β-內(nèi)酰胺酰化酶自剪切機(jī)制及其突變株的構(gòu)象變化.pdf

1、頭孢菌素?；?CA)和青霉素G?；?PGA)可用于生產(chǎn)重要的制藥中間體，具有極高的應(yīng)用價值。這兩個β內(nèi)酰胺酰化酶同屬于N端親核(Ntn)水解酶超家族，擁有一個Ntn活性中心以及一個特征性的αββα核心結(jié)構(gòu)區(qū)。早期的研究已提出了這類酶水解底物的分子機(jī)制:即由β亞基N端的Ntn活性中心Serβ1的側(cè)鏈羥基負(fù)責(zé)親核進(jìn)攻，同時它的α氨基作為廣義堿參與質(zhì)子傳遞。此外還發(fā)現(xiàn)這兩個酶還需兩步自剪切成熟過程，并釋放出一條前體肽。第一步自剪切的機(jī)理較

2、為明確，然而第二步自剪切的機(jī)制尚有爭論。
　　本研究首先針對CA的第二步自剪切機(jī)制展開研究，通過高分辨質(zhì)譜分析慢剪切突變、切點移動突變和前體肽縮短突變，確認(rèn)了CA的第二步剪切位點為Glu159-Gly160，并且Glu是重要的識別位點而Gly的短側(cè)鏈能減少空間位阻。通過分析自剪切的一級反應(yīng)動力學(xué)，第二步剪切反應(yīng)與底物水解反應(yīng)的相似性以及新發(fā)現(xiàn)的?；拿富钚院屯馇须拿富钚?，提出了分子內(nèi)Ntn反應(yīng)理論，即第二步自剪切反應(yīng)是在一個酶分子

3、內(nèi)由其自身的Ntn活性中心Serβ1進(jìn)行催化的，解決了存在已久的關(guān)于這步自剪切反應(yīng)機(jī)制的爭論。同時，結(jié)合前體肽縮短突變的蛋白仍可進(jìn)行自剪切的現(xiàn)象，表明第二步自剪切切點可以通過構(gòu)象變化跨越22(A)的距離與Ntn活性中心接近并完成催化，進(jìn)一步支持了分子內(nèi)Ntn反應(yīng)機(jī)制，并揭示了該酶動態(tài)催化過程。
　　對前體肽縮短且活性中心滅活(Sβ1A)的突變0aaS1A、2aaS1A以及4aaS1A的晶體學(xué)研究表明，突變后的結(jié)構(gòu)存在較大的勢能變化

4、，足以克服水解反應(yīng)和第二步自剪切反應(yīng)的活化能能壘，說明了酶的構(gòu)象變化對催化反應(yīng)有重要貢獻(xiàn)。
　　對CA和PGA及突變蛋白的溴代化合物標(biāo)記研究表明，溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸(BAc-7-ACA)、溴丙酰-7-氨基頭孢烷酸(BPr-7-ACA)及溴乙酰-丙氨酰-脯氨酸(BAc-AP)可親和標(biāo)記CA，而BAc-7-ACA，BPr-7-ACA和溴乙酰-6-氨基青霉烷酸(BAc-6-APA)可親和標(biāo)記PGA。這些溴代母核類似物的親和標(biāo)記過程

5、反映了底物母核部分與酶的相互作用，而與底物側(cè)鏈類似物苯甲基磺酰氟(PMSF)的親和標(biāo)記作用不同。但兩類抑制劑都標(biāo)記在了CA和PGA的Ntn活性中心Serβ1的側(cè)鏈羥基上，因此支持了關(guān)于Ntn反應(yīng)機(jī)制的經(jīng)典理論。同時發(fā)現(xiàn)了兩個αββα核心結(jié)構(gòu)區(qū)中的突變Sβ3M與Aβ5M對CA的酶活產(chǎn)生了影響，這些突變離底物結(jié)合區(qū)及活性中心都較遠(yuǎn)，這種影響反映了αββα核心結(jié)構(gòu)區(qū)對Ntn反應(yīng)的重要性，解釋了其進(jìn)化上的保守性。
　　通過以上對CA和PG