肥胖,代謝綜合征對小鼠尿控功能的影響及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：
　　從上世紀(jì)末至本世紀(jì)初，肥胖（obesity）已經(jīng)成為了一種廣泛存在社會現(xiàn)象。在世界范圍內(nèi)可預(yù)防的引發(fā)死亡和疾病的相關(guān)因素中，肥胖占領(lǐng)先地位，無論是兒童還是成年人，肥胖癥的比率一直在上升。
　　肥胖一般認(rèn)為是由于脂類，尤其是甘油三酯在體內(nèi)過多聚集所導(dǎo)致的一種病理狀態(tài)，可分為單純性肥胖和繼發(fā)性肥胖兩種類型，日常生活中所見到的肥胖一般為單純性肥胖，所占的比例在所有肥胖癥的95％以上，醫(yī)學(xué)上認(rèn)為單純性肥胖為原發(fā)性肥胖

2、，與個(gè)人遺傳因素，飲食和運(yùn)動習(xí)慣相關(guān)。目前，肥胖問題已不再局限于發(fā)達(dá)國家，對于經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的地區(qū)，在人們的飲食習(xí)慣改變及品種供應(yīng)日益豐富和生活方式向靜態(tài)變化的趨勢下，肥胖問題也迅速發(fā)展。在我國，自20世紀(jì)90年代與80年代起，超重者的比例已增加了近1倍，達(dá)到20-30%，城市人口中達(dá)到35-40%；我國大多人依然認(rèn)為肥胖是由于飲食過度及不注意個(gè)人飲食及運(yùn)動習(xí)慣造成的，不將其視作一種疾病，從而使得肥胖癥控制欠佳而更為普遍，進(jìn)而引發(fā)糖尿病，

3、心血管疾病，腫瘤及睡眠-呼吸紊亂等疾病，近來更多的研究認(rèn)為肥胖更是引發(fā)代謝綜合征的主要危險(xiǎn)因素。
　　代謝綜合征（metabolic syndromes，MetS）是近10年來受到普遍重視的一類疾病綜合征群，其主要表現(xiàn)為中心性肥胖，高血壓，高血糖，糖耐量異常（胰島素抵抗），高密度脂蛋白膽固醇血清水平降低，血脂代謝紊亂和微量蛋白異常等，其與糖尿病，代謝性疾病及心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)且發(fā)病率逐年攀升，在北美地區(qū)，MetS發(fā)病率已達(dá)3

4、4-39%，嚴(yán)重影響了人類的身心健康及生活質(zhì)量，已成為了世界性的公共衛(wèi)生問題。
　　前列腺增生癥（BPH），是以前列腺兩側(cè)葉和中葉增生為主所引起的老年男性常見疾病之一，往往伴有下尿路癥狀（LUTS）；下尿路癥狀是一系列以排尿不適癥狀形成的綜合征候群，已有大量證據(jù)表明肥胖，腰圍，體質(zhì)指數(shù)及體脂分布等與BPH和LUTS的發(fā)病相關(guān)。隨著肥胖與代謝綜合征研究的不斷深入。近年來，MetS與 BPH，LUTS，膀胱過度活動癥（OAB）及勃起功

5、能障礙(ED)等泌尿生殖系疾病的相關(guān)性研究成為了熱點(diǎn)。雖然已經(jīng)有部分臨床研究報(bào)道表明了在人體MetS與BPH，LUTS具有相關(guān)性，但由于此類研究領(lǐng)域仍較新，研究時(shí)間有限，動物實(shí)驗(yàn)及分子機(jī)制依然不清，實(shí)驗(yàn)方法及相關(guān)結(jié)論也不完善，大量臨床結(jié)論的基礎(chǔ)研究證據(jù)依然空白，缺乏完善的動物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行佐證，動物實(shí)驗(yàn)是進(jìn)一步了解分子機(jī)制最有效的方式，建立合理有效的動物模型對深入了解疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用。因此，我們嘗試使用肥胖動物模型來研究關(guān)于肥胖與代

6、謝綜合癥在泌尿系并發(fā)癥的影響，并對其代謝綜合征誘導(dǎo)的下尿路癥狀下分子通路表達(dá)進(jìn)行了初步研究。
　　研究目的：
　　1.以肥胖小鼠（B6.V-Lepob/J，obob mice）為研究對象，觀察肥胖可能導(dǎo)致代謝綜合征的特點(diǎn)，并行尿流動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，了解肥胖，代謝綜合征對尿控及排尿功能的改變情況；
　　2.對兩組小鼠存在明顯差異的指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性及回歸分析，了解造成排尿習(xí)慣改變的潛在危險(xiǎn)因素并探討相關(guān)分子機(jī)制，為臨床實(shí)驗(yàn)及研究提

7、供證據(jù)支持；
　　研究方法：
　　1.動物模型的建立：擬使用雄性瘦素（leptin）受體敲除小鼠（B6.V-Lepob/J小鼠）為實(shí)驗(yàn)組，正常C57BL/6N品系雄性小鼠為對照組（n=40）飼喂普通飼料28周，觀察不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體重（BW），身長(BL)，腰圍(WC)，血糖水平(BG)，空腹糖耐量（GTT），胰島素水平(INS)，總膽固醇含量（TCHO），游離脂肪酸水平(FFA)的變化情況；
　　2.按照時(shí)間點(diǎn)分布，觀

8、察小鼠尿動力學(xué)情況，通過尿量頻率實(shí)驗(yàn)和膀胱內(nèi)壓檢查實(shí)驗(yàn)共同實(shí)現(xiàn)；
　　3.通過影像學(xué)核磁共振檢查，了解實(shí)驗(yàn)中期和末期肥胖對前列腺及體脂分布情況的影響；并就相對顯著指標(biāo)與排尿頻率進(jìn)行相關(guān)性分析；
　　4.對28周后的小鼠組織行免疫組織化學(xué)染色和western blot（WB）檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況；
　　結(jié)果：
　　1. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠較正常C57BL/6N小鼠更易于表現(xiàn)出包括中心性肥胖

9、，高血糖，高胰島素血癥，血清總膽固醇升高等MetS癥狀；
　　2. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠較正常C57BL/6N小鼠易于出現(xiàn)下尿路改變，表現(xiàn)為排尿次數(shù)增多，膀胱儲尿容量改變，單次尿量減少，基礎(chǔ)膀胱壓及排尿壓峰值增高及排尿間隔時(shí)間減少等表現(xiàn)；
　　3.影像學(xué)核磁共振檢測Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠較正常C57BL/6N小鼠具有更大的前列腺及內(nèi)臟脂肪體積；
　　4.對兩組小鼠中具有統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)差異的數(shù)據(jù)行Person相關(guān)性分析后表明：體重指數(shù)（R=0.638），腹腔內(nèi)脂肪含量（R=0.853），前列腺體積（R=0.706），空腹血糖水平（R=0.712），血清胰島素水平（R=0.628）與血清膽固醇（R=0.729）含量與排尿頻率強(qiáng)相關(guān)；年齡（R=0.437），體重（R=0.483），腰圍（R=0.469），血清總膽固醇含量（R=0.467）與排尿頻率弱相關(guān)；(p<0.05)；
　　5.免疫組織化學(xué)HE染色顯示B6.

11、V-Lepob/J小鼠較正常對照組小鼠的前列腺組織中腺體細(xì)胞大量增生，有少量炎性細(xì)胞浸潤；WB結(jié)果顯示 B6.V-Lepob/J小鼠較正常對照組小鼠前列腺中的TGF-β表達(dá)增高；
　　結(jié)論：
　　1. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠可以作為新型研究代謝綜合征的動物模型，具有特征性，可重復(fù)性及相對穩(wěn)定性；
　　2. Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠可出現(xiàn)下尿路癥狀，主要以尿頻癥狀為主，其與代謝綜

12、合征癥狀及腹腔脂肪分布具有正相關(guān)性；
　　3.血糖水平，胰島素水平，前列腺體積及腹部脂肪體積均是下尿路癥狀產(chǎn)生的危險(xiǎn)因素，其中高血糖是下尿路癥狀的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；
　　研究背景：
　　尿失禁是一種以不自主尿液流出為主要癥狀的疾病，往往是由于膀胱括約肌功能下降或者是神經(jīng)性功能損傷造成，雖然其發(fā)病對機(jī)體造成的損傷并不嚴(yán)重，但卻會極大的降低患者的生活工作質(zhì)量并影響其心理健康，且以女性多發(fā)，容易誘發(fā)患者出現(xiàn)自閉，抑郁及孤僻特點(diǎn)[

13、1]。尿失禁在分類上有4種類型：壓力性尿失禁最為常見，多由于膀胱盆腔組織松散所致；急迫性尿失禁常因膀胱過度活動癥（overactive bladder，OAB）引發(fā);混合型尿失禁則兩者兼有，還有一類為功能性尿失禁，常由于藥物及疾病等因素導(dǎo)致膀胱貯尿功能下降所致。目前全球統(tǒng)計(jì)的年輕女性尿失禁人群已占到20%-30%，30-40歲的中年女性發(fā)病率為30-40%及老年女性發(fā)病率增高達(dá)到30-50%；尿失禁的危險(xiǎn)因素包括有年齡，種族與遺傳因素，

14、肥胖，分娩胎次等，其中尤以分娩對產(chǎn)道及盆底組織損傷最為常見，分娩產(chǎn)傷導(dǎo)致的盆底神經(jīng)，肌肉的機(jī)械性損傷，同時(shí)可伴有缺血缺氧出現(xiàn)的局部組織氧化應(yīng)激加重?fù)p傷，病患隨著年齡增長，尿失禁的癥狀出現(xiàn)并有加重趨勢。
　　正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)存在多種氧自由基及抗氧化酶，平衡著機(jī)體的氧化及抗氧化平衡，在炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物會加重細(xì)胞和組織損傷，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)亦包括兩種類型，一類以酶類抗氧化系統(tǒng)為

15、主，包括有超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px）等；另一類則為非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素C、維生素 E、麥角硫因、谷胱甘肽等。在酶類抗氧化系統(tǒng)中，SOD作為最主要的抗氧化酶之一發(fā)揮著重要的作用，在分型上，SOD也可分為3類：SOD1。SOD2及SOD3,常在研究中用于機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力的測評。
　　長期的高熱量，高脂肪飲食會誘發(fā)肥胖，高血糖癥，胰島素抵抗，高脂血癥等一系列代謝綜合征表現(xiàn)

16、，在胰島素抵抗情況下，生物機(jī)體抗感染及抗氧化應(yīng)激能力也隨之下降；壓力性尿失禁與產(chǎn)傷相關(guān)已有大量證據(jù)報(bào)道，產(chǎn)傷過程中缺血缺氧情況下產(chǎn)生的氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷及長期預(yù)后依然不清，有待更多合理的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究探討。
　　研究目的:
　　在上述背景基礎(chǔ)上，我們設(shè)計(jì)了該課題實(shí)驗(yàn)，以 MnSOD平滑肌特異性敲除小鼠為研究對象，嘗試發(fā)掘氧化應(yīng)激，尤其是平滑肌中MnSOD缺乏情況下小鼠尿失禁發(fā)生情況，更好的理解MnSOD對于尿失禁的作用意義

17、。
　　研究方法：
　　1.基因敲除動物：采用Cre-LoxP技術(shù)特異性敲除雌性小鼠（C57BL/6）平滑肌MnSOD基因，然后運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及免疫組化技術(shù)，對子代進(jìn)行基因型鑒定，對符合條件保留的條件敲除小鼠納入實(shí)驗(yàn)組（n=48），同時(shí)納入相同數(shù)量的C57BL/6品系雌性小鼠為對照組（n=48）；
　　2.再將實(shí)驗(yàn)組小鼠與對照組小鼠與12周齡時(shí)進(jìn)一步分亞組，分別使用高脂飼料（80%脂肪）及普通飼料飼喂12周

18、，檢測4組小鼠的在時(shí)間分布上的一般生長情況（體重，腰圍，體重指數(shù)），血糖變化，排尿功能；
　　3.24周后行陰道內(nèi)球囊擴(kuò)張模擬分娩產(chǎn)傷過程，測量術(shù)后4天，10天，20天的漏尿點(diǎn)（Leak point pressure。LPP）水平進(jìn)而評估其尿失禁水平；
　　4.實(shí)驗(yàn)結(jié)束取動物組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白分析及形態(tài)學(xué)等體外實(shí)驗(yàn)；
　　結(jié)果：
　　1.基因型分析中PCR及4-羥基壬烯醛(HNE)免疫組化切片顯示MnSOD基因已基

19、本敲除；
　　2.飼喂高脂飲食的小鼠較普食小鼠體重明顯增加，血糖增高，糖耐量異常，但組間無差異，飼喂普通飲食的小鼠無論基因敲除與否，體重未見明顯改變，組間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　3.飼喂高脂飲食合并基因敲除的小鼠在陰道擴(kuò)張術(shù)后4天，10天時(shí)LPP水平明顯低于其余組，普通飼料喂食的對照組小鼠 LPP水平最高，10天后基本達(dá)正常水平，各組中大多數(shù)小鼠在術(shù)后20天LPP水平基本恢復(fù)到正常水平；
　　4.飼喂高脂飲食小鼠尿道在術(shù)

20、后4天抗氧化蛋白SOD表達(dá)水平低于正常小鼠；以MnSOD敲除組為著，術(shù)后20天后，各組SOD表達(dá)水平基本恢復(fù)正常；
　　結(jié)論：
　　1. Cre-LoxP技術(shù)可用于MnSOD特異性平滑肌敲除小鼠的制備；
　　2.高脂飲食可誘導(dǎo)肥胖，高血糖，糖耐量異常等代謝綜合癥的出現(xiàn)；
　　3. MnSOD敲除后小鼠的漏點(diǎn)壓水平降低，但這種水平降低可以被長期飼喂高脂飲食加重，也可以隨時(shí)間恢復(fù)；
　　4.抗氧化蛋白，尤其是M