海洋雙殼類動(dòng)物金屬硫蛋白的提取與分析技術(shù)研究.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。由于水生生物體的MTs能被金屬誘導(dǎo)，而且誘導(dǎo)程度與水環(huán)境重金屬濃度之間存在一定的相關(guān)性，可間接反映出水環(huán)境中重金屬的污染水平，因此，海洋動(dòng)物體內(nèi)的MTs已被認(rèn)為是海水和沉積物重金屬污染的生物標(biāo)志物。而且海洋動(dòng)物MTs含量還被認(rèn)為是海洋金屬暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和健康評(píng)價(jià)的重要工具。近二十年來(lái)，為了將MTs應(yīng)用于海洋污染的生物監(jiān)測(cè)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后研究了

2、多種分析技術(shù)及相應(yīng)的提取方法。但是海洋動(dòng)物MTs的分離和定量分析尚無(wú)國(guó)際性的標(biāo)準(zhǔn)方法，因此本研究以暴露于含鎘海水的菲律賓蛤仔（Ruditapesphilippinarum）為試驗(yàn)材料，在文獻(xiàn)報(bào)道的汞飽和法和分光光度法的基礎(chǔ)上，分別對(duì)兩種方法的提取和測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　 對(duì)汞飽和法的優(yōu)化，依次采用正交設(shè)計(jì)和單因素設(shè)計(jì)對(duì)內(nèi)臟和鰓MT（以粗提液中的巰基含量表示）的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。所得到的內(nèi)臟最佳勻漿條件為：Tris-HCl緩

3、沖液濃度為0.02mol/L，pH值7.8，內(nèi)臟與緩沖液的質(zhì)量體積比(m/v)為1/5，其中，緩沖液的濃度對(duì)提取效果影響較大。最佳除雜條件為：勻漿液首先在4℃、20000g離心30min，再于80℃水浴加熱10min，然后于4℃15000g離心10min。
　　 所得到的鰓最佳勻漿條件為：Tris-HCl緩沖液濃度為0.02mol/L，pH值7.8，內(nèi)臟與緩沖液的質(zhì)量體積比(m/v)為1/4，其中，緩沖液的pH對(duì)提取效果影響較大

4、。最佳除雜條件為：勻漿液首先在4℃、25000g離心20min，再于80℃水浴加熱10min，然后于4℃15000g離心10min。
　　 測(cè)定條件優(yōu)化時(shí)，以菲律賓蛤仔的鰓組織為試驗(yàn)材料，逐一測(cè)定該方法的各因素對(duì)鰓組織Cd-MT提取液中汞含量的影響，由此得到汞飽和法測(cè)定雙殼類MT的適宜條件為：將稀釋4倍的Cd-MT提取液與Hg2+濃度50mg/L的10％三氯乙酸按等體積比混合后，孵化反應(yīng)5min，再加入1.5倍體積的2％牛血紅素

5、溶液，迅速在20000g離心20min。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的汞飽和法對(duì)蛤仔Cd-MT的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.95％，加標(biāo)回收率為71.08％～78.86％，檢出限為0.24μgHg/L，對(duì)應(yīng)于4.47μgMT/g組織。
　　 對(duì)于分光光度法的優(yōu)化，采用單因素設(shè)計(jì)分別對(duì)內(nèi)臟和鰓MT（以粗提液中的巰基含量表示）的除雜工藝和測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。內(nèi)臟除雜最佳工藝條件為：取1ml上清液加入1ml無(wú)水乙醇（-20℃預(yù)冷）和80μl氯仿，離心取上清液加入3倍

6、體積無(wú)水乙醇-20℃沉淀1h，6000g離心10min后棄去上清液，取沉淀加1.74ml無(wú)水乙醇和260μ1Tris-HCl（含蔗糖）振蕩沖洗沉淀，離心取沉淀，N2吹干得到MT干粉。最佳測(cè)定條件為：Ellman顯色試劑中NaCl濃度為0.5mol/L。經(jīng)優(yōu)化的分光光度法測(cè)定內(nèi)臟MT相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.20％，加標(biāo)回收率在90.09～96.85％之間，檢測(cè)限9.98μgMT/g組織。
　　 鰓MT除雜階段最佳工藝條件：取1ml上清液

7、加入1ml無(wú)水乙醇（-20℃預(yù)冷）和40μ1氯仿，離心取上清液加入3倍體積無(wú)水乙醇-20℃沉淀1h，6000g離心10min后棄去上清液，N2吹干得到MT干粉。最佳測(cè)定條件：Ellman顯色試劑中不含NaCl。經(jīng)優(yōu)化的分光光度法測(cè)定鰓MT相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.92％，加標(biāo)回收率在91.88～101.29％之間，檢測(cè)限6.61μgMT/g組織。
　　 綜上所述，相對(duì)于汞飽和法，分光光度法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、成本低，試驗(yàn)器材容易獲