Zn-金屬硫蛋白間接競爭型ELISA的建立與應用.pdf

1、ELISA以其快速、準確、安全、簡便的特點而成為定量測定生物體內微量有機物的理想方法.該實驗的目的就是為了建立一套快速、有效、方便并能定量測定豬體組織中MT含量的ELISA法,為動物科學中的研究和應用提供MT的定量測定技術.1.豬MT抗小鼠抗血清的制備:用戊二醛法將純品Zn-MT與載體蛋白(BSA)偶聯后,作為人工抗原,對昆明小鼠皮下注射.首次免疫時抗原中MT量分別為8ug/只、16ug/只、32ug/只、64ug/只、128ug/只;

2、加強免疫時所用抗原量依次加倍.前3次免疫時采用的是弗氏完全佐劑乳化,后3次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化.兩批小鼠加強免疫的時間隔分別為10日和14日.用免疫雙擴散方法測定抗血清效價.得出以下結論:當首次免疫抗原中MT的量為16-32ug/只,每次加強免疫時抗原量加倍,加強免疫間隔時間為10日時,其免疫效果較佳,可使大部分小鼠抗血清效價達到1:16以上.2.抗體的純化及鑒定:將效價達到1:16以上的MT小鼠抗血清用飽和硫酸銨鹽析法濃縮出γ-

3、球蛋白,然后用DEAE-Sephadex A50層析柱分離提純IgG.實驗中發(fā)現洗脫液pH值為7.4時洗脫第一峰即為純化的IgG,用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠濃度梯度電泳鑒定層析洗脫下的IgG達到電泳純.對純化后的IgG進行辣根過氧化物酶標記,用直接ELISA鑒定其為MT的特異性抗體.3.ELISA的建立:運用固相抗原間接非競爭型ELISA和固相抗原間接競爭型ELISA檢測豬體組織中部分樣品MT的含量,結果表明:用間接非競爭型ELIS

4、A測定樣品時其結果不夠穩(wěn)定,同一樣品所對應的0D值相差較大,此方法僅適合于樣品中MT定性檢測;采用間接競爭型ELISA測定樣品,OD值比較穩(wěn)定.用方陣滴定法確定了間接競爭型ELISA的各項具體條件:抗原最佳包被濃度為6.25ug/ml,一抗(鼠抗豬)使用適宜濃度為50ug/ml,酶標抗體(山羊抗小鼠)的使用濃度為1/8000倍,反應時間為3hr.用標準MT,采用間接競爭型ELISA方法擬合的標準曲線回歸方程為:y=105×2(22.32