類(lèi)金屬硫蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)及提取工藝的研究.pdf

1、金屬硫蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)MT，是在動(dòng)物、植物、微生物中廣泛存在著的一類(lèi)低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。本文以酵母菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)所產(chǎn)生的Cu-MT為研究對(duì)象。通過(guò)對(duì)數(shù)種不同酵母菌株進(jìn)行篩選比較得到一個(gè)較優(yōu)菌株，再進(jìn)行誘變處理，得到優(yōu)勢(shì)出發(fā)菌株N'-1。本論文對(duì)Cu-MT的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)以及超聲提取工藝作了初步的研究，并對(duì)其清除羥自由基性質(zhì)等作了探討。 本論文根據(jù)熱帶假絲酵母Cu-1、釀酒酵母Cu-2、Cu-3、Cu-4和啤酒酵母Cu-5

2、菌株自然產(chǎn)金屬硫蛋白能力的分析，篩選得到較優(yōu)菌株Cu-3(類(lèi)金屬硫蛋白產(chǎn)量以巰基活性計(jì)達(dá)0.012)。以Cu-3菌株為誘變出發(fā)菌株，交替進(jìn)行了兩次紫外線(xiàn)(UV)和兩次亞硝基胍(NTG)誘變，并對(duì)突變株進(jìn)行篩選得到突變株N'-1，其產(chǎn)金屬硫蛋白的能力(以巰基活性表示)達(dá)到0.041左右，較出發(fā)菌株(產(chǎn)Cu-MT以巰基活性計(jì)為0.012)提高了約3.42倍，且具有很好的遺傳穩(wěn)定性。 突變株N'-1菌株生產(chǎn)Cu-MT的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程

3、的研究中綜合考察了活化培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)Cu試劑類(lèi)型、濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間、溫度、誘導(dǎo)培養(yǎng)基裝液量、接種量以及搖床轉(zhuǎn)速8個(gè)培養(yǎng)條件對(duì)菌株Cu-MT產(chǎn)量的影響。最終確定了N'-1菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件為：選擇CuCl2為誘導(dǎo)Cu-MT試劑、濃度為1.0mmol/L、活化培養(yǎng)時(shí)間48h、誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度30℃、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間48h、接種量lmL/50mL培養(yǎng)液、誘導(dǎo)培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL三角瓶、搖床轉(zhuǎn)速140r/min。按照以上培養(yǎng)條件

4、安排實(shí)驗(yàn)，測(cè)得類(lèi)金屬硫蛋白產(chǎn)量(以巰基活性計(jì))為0.074。 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)Cu-MT的超聲提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，綜合考慮了料液比、超聲提取強(qiáng)度、超聲提取時(shí)間、熱變性時(shí)間等因素對(duì)提取效果的影響，最后得到了Cu-MT超聲提取的最優(yōu)條件為：pH8.6Tris-HCl緩沖液與干菌體之間的料液比(g∶mL)為1∶15，200W超聲提取30min以及80℃熱變性6min。在此提取條件下，提取得到的Cu-MT以巰基活性計(jì)