擬南芥EDR2定位、Ca結合特性和在Ca依賴性生長中的生理功能研究.pdf

1、鈣是植物生長發(fā)育必需礦質(zhì)元素之一。目前Ca相關植物生物學研究主要集中在兩個方面:植物細胞吸收和儲存Ca2+的分子機制;細胞質(zhì)Ca2+作為第二信使介導植物內(nèi)源和環(huán)境信號轉(zhuǎn)導的分子機理。但是Ca2+直接調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的分子機理尚未深入研究。
　　擬南芥EDR2（ENHANCED DISEASE RESISTANCE2）蛋白含有三個預測結構域:PH（Pleckstrin Homology）、START(STAR Transfer)和D

2、UF1336(Domain of Unknown Function1336)。已有研究證明缺失AtEDR2的擬南芥突變體atedr2的葉片通過水楊酸途徑表現(xiàn)抗白粉菌的表型。但是有關AtEDR2蛋白確切的亞細胞定位和在植物Ca2+依賴性生長方面的功能尚未有報道。本論文在這些方面的主要實驗結果如下:
　　(1) AtEDR2啟動子活性主要集中在葉、根、花序和角果柄組織。在葉片表面的表皮毛中也有強活性，但缺失AtEDR2基因?qū)M南芥葉表

3、面表皮毛的密度和性狀沒有明顯影響。通過構建編碼AtEDR2全長和不同結構域同綠色熒光蛋白GFP的融合基因，在煙草瞬時表達以后發(fā)現(xiàn)，AtEDR2定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可以同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記蛋白ER∷mCherry共定位。同時AtEDR2的PH結構域是AtEDR2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位必需結構域。
　　(2)通過對比擬南芥野生型Col和atedr2突變體在含有不同濃度和種類的礦質(zhì)元素培養(yǎng)基上的生長，我們發(fā)現(xiàn)atedr2只有在Ca2+養(yǎng)分缺乏的培養(yǎng)基上表現(xiàn)葉和

4、根生長被顯著抑制的表型，證明AtEDR2特異性調(diào)節(jié)擬南芥Ca2+依賴性根和葉的生長。無論生長在全營養(yǎng)還是Ca2+缺乏培養(yǎng)基上，擬南芥Col和atedr2的根和葉的總鈣以及水溶性鈣含量沒有顯著差異。這說明atedr2低Ca2+敏感的生長表型不是因為其吸收或是積累Ca2+能力降低而導致的。我們在體外表達純化了帶有GST(Glutathione-S-Transferase)標簽的AtEDR2結構域片段，利用MicroCal iTC200微量熱

5、等溫滴定量熱儀，證明AtEDR2的PH結構域具有Ca2+結合特性。有研究證明AtEDR2的PH結構域可以結合磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P，本研究的組織免疫熒光實驗證明AtEDR2不參與PI4P的分布，很有可能是通過PH結構域的Ca結合特性調(diào)節(jié)Ca依賴生長。
　　(3)基于蛋白組學數(shù)據(jù)，我們對在Col和atedr2之間、豐度顯著變化蛋白對應的基因突變體進行純合鑒定，進一步進行Ca依賴的生長表型分析，發(fā)現(xiàn)只有atstt3b基因缺失突變

6、體同atedr2一樣，表現(xiàn)低Ca敏感表型。AtSTT3B基因被預測編碼位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的低聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶，負責內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)原生蛋白最初的糖基加載過程。盡管低Ca處理確實可以顯著提高總蛋白N-糖基化水平，但是，無論是生長在全營養(yǎng)還是Ca2+缺乏培養(yǎng)基上，擬南芥Col和atedr2突變體之間，總蛋白N-糖基化程度沒有區(qū)別。證明AtEDR2不參與低鈣脅迫對蛋白N-糖基化的調(diào)節(jié)。
　　(4)基于芯片的表達譜分析發(fā)現(xiàn)，低Ca處理誘導大量和過氧化物以及

7、水楊酸積累相關基因的表達。組織化學染色也證明在低Ca的情況下，atedr2突變體的葉片比野生型Col積累更多的過氧化氫。同時這些基因的轉(zhuǎn)錄水平在atedr2突變體內(nèi)升高的倍數(shù)顯著高于野生型Col，證明AtEDR2負調(diào)控低Ca誘導的基因轉(zhuǎn)錄反應。在atedr2-6/ein2-1雙突變體中，阻斷atedr2-6突變體內(nèi)乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑對atedr2-6在低Ca條件下生長受抑制的表型沒有影響。但是阻斷水楊酸的合成可以部分恢復atedr2-6在