二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫(DBDCT)對大鼠心臟和血管的毒性作用.pdf

1、研究背景：
　　 抗腫瘤藥物的心臟毒性已經(jīng)嚴重影響患者的遠期生存質(zhì)量，許多癌癥幸存者發(fā)生心臟病的危險與癌癥復(fù)發(fā)危險持平。一些惡性腫瘤幸存者有可能因心血管的并發(fā)癥而影響療效，甚至危及生命。因此，探討抗腫瘤藥物對心腦血管的影響及其作用機制無疑具有重要意義。本課題組以芳香異羥肟酸等螯合配體合成篩選得到的新型有機錫化合物二-（4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT），具有高效廣譜抗癌活性，但DBDCT對心血管系統(tǒng)的毒性作用目前尚

2、未得到較全面的評估，更沒有進一步的毒性作用機制分析的研究。因此，本課題的主要內(nèi)容為研究DBDCT在心血管系統(tǒng)中的作用及其可能機制。
　　 心血管系統(tǒng)的毒性損傷是由多因素共同作用的結(jié)果。這些因素包括自由基損傷、鈣超載、線粒體損傷等，它們之間互相聯(lián)系，互為因果，形成心血管毒性的惡性網(wǎng)絡(luò)，共同引導(dǎo)毒性的發(fā)生和發(fā)展。細胞胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）濃度變化可作為對外源性化合物侵襲的敏感信號。而鈣穩(wěn)態(tài)失衡被認為是所有細胞死亡的最后通路。

3、　　 心功能的改變和血管舒縮的變化通常是與肌細胞胞內(nèi)鈣濃度的變化緊密相關(guān)的，是反映細胞鈣轉(zhuǎn)運異常的敏感指標(biāo)。我們在研究有機錫類化合物DBDCT對大鼠心臟作用的預(yù)實驗過程中發(fā)現(xiàn)，DBDCT主要對心臟的舒張功能產(chǎn)生抑制，同時伴有冠脈流量的異常增加，而且在灌流沖洗后心功能繼續(xù)惡化，直至心臟停跳，呈現(xiàn)一種不可逆的變化。這表明，在DBDCT作用下心肌和冠脈平滑肌細胞的鈣轉(zhuǎn)運發(fā)生了顯著變化，這些變化涉及到DBDCT毒性作用的關(guān)鍵，值得我們進一步深

4、入研究。本課題擬圍繞細胞的鈣轉(zhuǎn)運問題，通過研究DBDCT對在體和離體大鼠心功能、相關(guān)的生化指標(biāo)、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、心肌細胞離子電流和細胞內(nèi)鈣濃度變化的影響，觀測DBDCT對心臟的毒性作用及作用機制；通過觀測DBDCT對冠脈流量和大鼠胸主動脈環(huán)張力的影響，以及離子通道阻斷劑的干預(yù)效應(yīng)，探討DBDCT對血管毒性的作用及其機制。
　　 一、二-（4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT）對大鼠心臟的毒性作用
　　 目的：

5、r>　　 研究不同濃度DBDCT對在體大鼠心臟心功能的急性和慢性作用、相關(guān)的生化指標(biāo)及組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。
　　 方法：
　　 1．急性作用模型制備
　　 健康成年SD大鼠，麻醉，行左心室插管手術(shù)，腹腔注射給藥，給藥后記錄2 h。記錄藥前和藥后左心室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左心室主動收縮壓（LVSP-LVEDP）、左室壓力最大上升和下降速率（±dp/dtmax），II導(dǎo)心電圖，并采集血清

6、作酶學(xué)指標(biāo)測定。
　　 2．慢性作用模型制備
　　 健康成年SD大鼠，隨機分為實驗組和對照組，隔天腹腔注射給藥，于給藥后的第10天和第20天兩個時間點，測量左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左心室主動收縮壓（LVSP-LVEDP）及左室壓力最大上升及下降速度（±dp/dtmax）、II導(dǎo)心電圖、體重（BW）、心室重量（VW），并作酶學(xué)指標(biāo)測定和心肌組織病理切片觀察其組織學(xué)變化。
　　 二、二-（

7、4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT）
　　 對大鼠心臟毒性作用的機制探討
　　 目的：
　　 觀測DBDCT對離體心功能、酶學(xué)指標(biāo)、心肌細胞離子電流和細胞內(nèi)鈣濃度變化的影響，探討DBDCT對心肌毒性的作用及其機制。
　　 方法：
　　 1．離體灌流心臟模型的制備
　　 健康成年SD大鼠，麻醉，開胸取出心臟，經(jīng)主動脈逆行灌流臺氏液，左室內(nèi)置入水囊并與Powerlab及Chart

8、6.0生物信號數(shù)據(jù)記錄及分析系統(tǒng)連接，維持左心室舒張末期壓力（LVEDP）2-10mmHg。心臟穩(wěn)定搏動的標(biāo)志為：左室主動收縮壓（LVSP-LVEDP）大于60mmHg，HR大于200次／分。平衡30min后，持續(xù)給藥30min，然后恢復(fù)正常臺氏液灌流30min。測量左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左心室主動收縮壓（LVSP-LVEDP）及左室壓力最大上升及下降速率（±dp/dtmax）、冠脈流量，并采集灌流液作酶學(xué)

9、指標(biāo)測定和心肌組織病理切片觀察其組織學(xué)變化。
　　 2．單細胞離子電流的測定
　　 選健康成年雄性SD大鼠，用膠原酶法急性分離大鼠左心室肌細胞，采用全細胞膜片鉗技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄心室肌細胞Ica、Ito、Ina和Ina/Ca，分別觀測10-7M、1×10-6M、3×10-6M、5×10-6M、8×10-6M、10-5M六個濃度濃度DBDCT對上述離子電流的影響。
　　 3．大鼠心室肌細胞鈣瞬變和靜息鈣濃度的

10、測定
　　 用膠原酶法急性分離大鼠心室肌細胞，F(xiàn)luo-3 AM或Fluo-4 AM染色，采用IonOptix單細胞動緣同步檢測系統(tǒng)同步監(jiān)測細胞收縮舒張功能和鈣瞬變的變化；在激光共聚焦顯微鏡下選擇細胞狀態(tài)良好的視野，在有鈣和無鈣細胞外液的條件下，觀測DBDCT 1×10-5M，引起的細胞熒光強度的變化，以及肌漿網(wǎng)RyR阻斷劑ryanodine 100μmol/L和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑thapsigargin 5μmol/L干預(yù)后的效

11、應(yīng)。
　　 三、二-（4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT）對大鼠主動脈環(huán)的作用及機制
　　 目的：
　　 通過觀測DBDCT對大鼠胸主動脈環(huán)張力的影響，以及離子通道阻斷劑的干預(yù)效應(yīng)，探討DBDCT對血管毒性的作用及其機制。
　　 方法：
　　 采用離體血管張力實驗方法。觀察DBDCT在5×10-6 M，1×10-5 M濃度時,對氯化鉀（KCl，60mmol/L）誘發(fā)大鼠離體胸主動脈環(huán)收

12、縮的影響以及在5×10-6 M濃度時，對去甲腎上腺素（NE，1×10-6 mol/L）誘發(fā)大鼠離體胸主動脈環(huán)收縮的影響。觀察內(nèi)皮、一氧化氮合酶（eNOS）抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME, 10-4 mol/L）、環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（indometacin, 10-5 mol/L）、KV通道阻斷劑四胺基吡啶（4-AP, 1×10-3 mol/L）、KATP通道阻斷劑格列苯脲（Gli, 1×10-5 mol/L）、Kca通

13、道阻斷劑四乙胺（TEA, 1×10-2 mol/L）、KiR通道阻斷劑氯化鋇（BaCl2, 1×10-3 mol/L）對DBDCT作用的影響，以及DBDCT對血管環(huán)外鈣依賴性收縮和內(nèi)鈣依賴性收縮的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1．二-（4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT）對大鼠心臟具有與劑量和時間相關(guān)的毒性作用。表現(xiàn)為心功能抑制并逐漸加重，特別是對舒張功能的抑制，血清LDH和組織MDA升高，以及心肌組織的炎性浸

14、潤。與已有的文獻結(jié)果相比，其心臟毒性作用相對阿霉素較弱。
　　 2．DBDCT可劑量依賴性地抑制大鼠心肌Ica-L，同時對肌漿網(wǎng)ryanodine受體有很強的激動作用，后者可能是產(chǎn)生胞內(nèi)鈣持續(xù)升高和心肌舒張功能減退的主要原因。
　　 3．DBDCT可顯著增加冠脈流量，這一作用不被一氧化氮合酶抑制劑L-NAME完全阻斷，表明該藥物對冠脈平滑肌可能具有直接的舒張作用。
　　 4．DBDCT對KCl和NE誘發(fā)的大鼠胸主