酵母底盤細胞中7-脫氫膽甾醇的模塊化設計與合成.pdf

1、7-脫氫膽甾醇不僅是重要的甾體激素中間體,還是合成維生素D3的關鍵前體,更可以作為制備膽甾相液晶的原料,具有明顯的藥用效果和廣闊的市場前景。傳統(tǒng)的7-脫氫膽甾醇制備方法主要是化學合成法,但由于化學法工藝流程長,反應步驟多,收率低,副產物去除過程復雜,能耗高且易對環(huán)境造成嚴重污染,極大限制了7-脫氫膽甾醇的生產和應用。雖然也有關于酶促生化反應生產7-脫氫膽甾醇的相關報道,但成本問題始終制約了該技術的工業(yè)化應用。利用生物技術合成7-脫氫膽甾

2、醇可以解決以上的困難,國外已有課題組實現(xiàn)7-脫氫膽甾醇的生物全合成,但利用合成生物技術構建7-脫氫膽甾醇人工合成細胞,并對7-脫氫膽甾醇合成功能模塊與底盤細胞的適配關系進行研究,目前還沒有相關的報道。
　　本研究利用合成生物學技術,從7-脫氫膽甾醇合成功能模塊的構建和改造、酵母底盤細胞的優(yōu)化兩方面,注重挖掘功能模塊與底盤細胞間的適配關系,降低酵母底盤細胞的代謝壓力,提高與功能模塊的適配性,從而增加7-脫氫膽甾醇產量。本課題主要包括

3、三部分工作:過表達酵母固醇合成途徑中的內源基因tHMGR、ERG1,敲除非必需基因ERG6、ERG5以抑制酵母固醇向麥角固醇的轉化,通過對模塊內不同強度啟動子的考察,得到優(yōu)選的改造后酵母底盤SyBE_000956;引入人體來源的固醇C-24還原酶,同時過表達內源基因ERG3、ERG2,得到9個7-脫氫膽甾醇合成功能模塊;將構建的功能模塊導入底盤細胞,得到36株7-脫氫膽甾醇人工合成細胞,通過對不同強度啟動子、改造后的不同底盤細胞等指標的

4、考察,研究外源功能模塊與底盤細胞間的適配機制。結果發(fā)現(xiàn):底盤細胞相同的情況下,不同強度的啟動子與底盤細胞的適配性由好到差依次為TDH3p、PGK1p、TDH1p;只包括單個基因元件DHCR24的功能模塊構成的人工細胞7-脫氫膽甾醇的產量高于大部分包括基因元件ERG3、ERG2、DHCR24的功能模塊所構成的人工細胞;外源功能模塊相同的情況下,以優(yōu)化后的SyBE_000956為底盤的人工合成細胞,7-脫氫膽甾醇含量最高,與功能模塊的適配性