7-脫氫膽固醇生物合成釀酒酵母的構(gòu)建和后鯊烯路徑的研究.pdf

1、7-脫氫膽固醇(7-DHC)作為合成維生素D3的重要前體，有著廣泛的醫(yī)藥和臨床應(yīng)用。本研究將外源基因C-24還原酶(DHCR24)導(dǎo)入釀酒酵母中，成功實(shí)現(xiàn)了7-脫氫膽固醇的異源合成。
　　將功能外源基因C24位雙鍵還原酶DHCR24分別導(dǎo)入固醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶（ERG6）或固醇C-22脫氫酶（ERG5）的單敲酵母菌株中，結(jié)合內(nèi)源tHMGR的過(guò)表達(dá)來(lái)增加前體量，最終可獲得7-DHC的人工生產(chǎn)菌株。外源基因DHCR24模塊的導(dǎo)入實(shí)現(xiàn)

2、了產(chǎn)物的從零到有。上游內(nèi)源基因tHMGR基因的過(guò)表達(dá)雖然會(huì)導(dǎo)致鯊烯的大量積累，但會(huì)給后續(xù)固醇合成提供前體物，使產(chǎn)量大幅提高。敲除ERG6的菌株較ERG5敲除菌株而言，雖然生長(zhǎng)趨勢(shì)略差但會(huì)直接增加代謝底物酵母固醇的積累，使固醇整體水平處于較高狀態(tài)，利于產(chǎn)物生成。最終底盤(pán)細(xì)胞與內(nèi)外源模塊相互配合，使得人工合成菌株的產(chǎn)量為3.4mg/L。
　　進(jìn)一步針對(duì)7-DHC合成路徑中的后鯊烯路徑內(nèi)源基因進(jìn)行比較，用固醇類(lèi)物質(zhì)的變化來(lái)研究7-DHC

3、合成路徑的內(nèi)源關(guān)鍵基因。發(fā)酵結(jié)果表明，后鯊烯路徑內(nèi)源基因ERG2-ERG3的聯(lián)合過(guò)表達(dá)使得7-DHC的產(chǎn)量有略微提高。原因在于ERG2-3位于酵母固醇的下游，對(duì)7-DHC的合成起了推動(dòng)作用。通過(guò)產(chǎn)物差異性的比較，推斷了一系列未知的固醇類(lèi)物質(zhì)，證明了DHCR24的底物非特異性。各類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量的變化證實(shí)了后鯊烯路徑內(nèi)源基因模塊對(duì)整體固醇相對(duì)含量的變化及固醇總量的調(diào)節(jié)作用，結(jié)合PCA分析后，得出一致性結(jié)論:調(diào)節(jié)后鯊烯路徑基因模塊會(huì)引起明顯的

4、固醇成分差異，但其中最顯著影響的是ERG11單基因模塊和ERG2-3組合模塊。ERG11和ERG2-ERG3是7-DHC合成路徑上的關(guān)鍵基因模塊。
　　針對(duì)生物體內(nèi)底物復(fù)雜，產(chǎn)物生成后分離純化困難等問(wèn)題，探索體外生物反應(yīng)體系。首先以?xún)蓚€(gè)已知外源基因LXYL-P1-2和DBAT為例，試驗(yàn)PURESystem無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)體外表達(dá)體系。DNA片段加入體系后成功檢測(cè)到了各蛋白的表達(dá)。同時(shí)，將兩基因在大腸桿菌中表達(dá)，之后直接利用細(xì)胞