達(dá)瑪烯二醇生物合成模塊的構(gòu)建及其與釀酒酵母細(xì)胞的適配.pdf

1、人參作為傳統(tǒng)的中藥材具有保護(hù)心血管,抗疲勞,抗衰老,抗癌,保肝和增強(qiáng)免疫力的藥理作用。人參皂苷是中藥人參的主要活性成分。目前人參皂苷的生產(chǎn)還主要依賴(lài)于植物栽培、植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化的方式;盡管相關(guān)研究已取得很大進(jìn)展,但人參皂苷的生產(chǎn)效率依然不能滿足市場(chǎng)的需求。近年來(lái),合成生物學(xué)在植物萜類(lèi)化合物微生物合成上的成功應(yīng)用,為人參皂苷的微生物合成提供了可行的參考方案。
　　釀酒酵母具有安全、培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰、基因操作成熟

2、、次級(jí)代謝有限的優(yōu)點(diǎn),是優(yōu)秀的細(xì)胞工廠。由于釀酒酵母的類(lèi)異戊二烯途徑能夠提供萜類(lèi)化合物的重要前體,因此以釀酒酵母為底盤(pán)細(xì)胞構(gòu)建合成植物萜類(lèi)化合物酵母工程細(xì)胞具有相對(duì)的優(yōu)勢(shì)。
　　本文首先構(gòu)建具有達(dá)瑪烯二醇合成酶表達(dá)模塊的釀酒酵母工程菌,然后以提高三萜類(lèi)化合物前體2,3-氧化鯊烯的積累為目標(biāo),通過(guò)對(duì)酵母類(lèi)異戊二烯途徑的關(guān)鍵基因3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因Hmg1、法尼基焦磷酸合成酶Erg20、鯊烯環(huán)氧酶Erg1進(jìn)行過(guò)表達(dá)

3、,對(duì)甲基酵母甾醇脫甲基酶基因Erg27進(jìn)行弱化表達(dá),為三萜類(lèi)化合物的合成提供良好的平臺(tái)。
　　生物模塊的導(dǎo)入往往會(huì)對(duì)底盤(pán)細(xì)胞造成很大影響,甚至抑制底盤(pán)細(xì)胞的生長(zhǎng),也使得生物合成途徑不能有效工作。因此,本文通過(guò)對(duì)植物源的達(dá)瑪烯二醇合成酶的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化使其在釀酒酵母細(xì)胞中具有更高的轉(zhuǎn)錄水平;構(gòu)建白假絲酵母Erg1的表達(dá)載體,以期在蛋白水平對(duì)酵母內(nèi)源關(guān)鍵基因Erg1進(jìn)行優(yōu)化;并融合表達(dá)達(dá)瑪烯二醇合成酶和鯊烯環(huán)氧酶以實(shí)現(xiàn)模塊與底