釀酒酵母細(xì)胞PKA高活性與細(xì)胞熱擊抗性的研究.pdf

1、釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)存在兩種與cAMP相關(guān)的信號(hào)通路,分別由異三聚體G蛋白和小G蛋白R(shí)as介導(dǎo)。釀酒酵母的Ras-cAMP信號(hào)通路對(duì)酵母細(xì)胞的代謝、增殖、分化及脅迫抗性具有重要作用。Ras-cAMP信號(hào)通路的下游直接靶標(biāo)是cAMP依賴(lài)性的蛋白激酶A即PKA；當(dāng)Ras蛋白活性過(guò)高時(shí),PKA活性亦隨之升高。PKA作為絲／蘇氨酸激酶,可令其靶蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化。借助于磷酸化作用,PKA可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)條件和壓力狀況的應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程。研

2、究表明,釀酒酵母細(xì)胞PKA的活性可影響細(xì)胞的熱擊抗性；在PKA活性過(guò)高的情況下,釀酒酵母細(xì)胞的熱擊抗性較野生型明顯降低。
　　 為進(jìn)一步深入探討PKA高活性與細(xì)胞熱擊抗性之間的關(guān)系,本研究從W303—la YCp22RASva119菌株出發(fā),利用mTn-lacZ／LEU2誘變文庫(kù)隨機(jī)插入其染色體的任意部位形成轉(zhuǎn)座子。mTn文庫(kù)轉(zhuǎn)入W303-la YCp22RAS2va119菌株后,若轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)是抗性相關(guān)基因的ORF或順式作用

3、元件,則所形成突變株的熱擊抗性可能會(huì)有所改變。純化所得轉(zhuǎn)化子,檢驗(yàn)其熱擊抗性,鑒別出六株熱擊抗性增強(qiáng)突變株；其中ZL7、ZL9和ZL13熱擊耐受時(shí)間高達(dá)6min,而ZL10、ZL11和ZL16的熱擊耐受時(shí)間亦增至3min。再用過(guò)pRSQ2-URA3質(zhì)?；厥砧b別轉(zhuǎn)座子在染色體上的插入位點(diǎn),確認(rèn)發(fā)生突變的基因；其中ZL7突變株為NOP7和RAS2雙失活菌株,ZL9突變株為ULP2失活菌株,ZL10和ZL16突變株均為NFS1失活菌株,ZL1