合成達(dá)瑪烯二醇釀酒酵母底盤細(xì)胞性能優(yōu)化.pdf

1、植物萜類天然化合物在人們的生活中有著重要的作用，其中三萜化合物人參皂苷就具有很強(qiáng)的藥用價值，具有抗炎、抗腫瘤活性。達(dá)瑪烯二醇是一種人參皂苷的合成前體物，該前體物的積累有利于促進(jìn)人參皂苷的生物合成。本文對達(dá)瑪烯二醇合成酶（DS）蛋白活性進(jìn)行了研究，并且將優(yōu)化的外源基因DS導(dǎo)入釀酒酵母底盤中，調(diào)整優(yōu)化了生產(chǎn)達(dá)瑪烯二醇的代謝途徑，提高了達(dá)瑪烯二醇的產(chǎn)量。
　　首先，根據(jù)TMHMM和TMPRED確定了DS序列中的跨膜區(qū)域，為得到游離DS蛋

2、白以及研究跨膜區(qū)后PFTB重復(fù)序列對酶活性的影響，構(gòu)建了表達(dá)截短DS的酵母菌株W303tDS0和W303tDS4。基于現(xiàn)已知的9個達(dá)瑪烯醇合成酶蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)了29個氨基酸差異位點(diǎn)。為研究差異位點(diǎn)對DS活性的影響，本文對篩選的4個序列差異位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建了突變DS表達(dá)菌株W303DSΔa、W303DSΔ29、W303DSΔ252以及W303DSΔ624。截短和突變DS的菌株達(dá)瑪烯二醇產(chǎn)量出現(xiàn)不同程度的降低，說明截短和突變的位點(diǎn)對D

3、S活性有影響，可能是DS蛋白潛在活性位點(diǎn)。
　　其次，基于I-TASSER和MODELLER對DS蛋白進(jìn)行同源建模，并對蛋白模型去Clash優(yōu)化得到最終的DS模型。模型顯示DS蛋白包含兩個α桶狀結(jié)構(gòu)區(qū)域，它們之間通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)和3個較小的β結(jié)構(gòu)連接在一起。蛋白活性位點(diǎn)的空腔結(jié)構(gòu)處于兩個大型結(jié)構(gòu)域中間，即整個蛋白分子的中心區(qū)域?；诘玫降腄S蛋白三維結(jié)構(gòu)，確定DS蛋白的活性催化位點(diǎn)為N端第488位的天冬氨酸Asp，它負(fù)責(zé)環(huán)化反應(yīng)的第一

4、步，給2,3-氧化鯊烯的環(huán)氧部分提供質(zhì)子。Asp488由它三維空間結(jié)構(gòu)臨近的第489位和第568位的兩個半胱氨酸Cys激活。Asp488，Cys489和Cys568這三個氨基酸在氧化鯊烯環(huán)化酶中展現(xiàn)出很強(qiáng)的保守性。此外，Trp421，Phe477， Trp538，Trp616，Tyr263，Tyr732起到穩(wěn)定2,3-氧化鯊烯成環(huán)過程中底物折疊的作用。Cys264，Tyr268，Ile559是與底物進(jìn)入催化活性位點(diǎn)的通道有關(guān)的活性位點(diǎn)。

5、
　　構(gòu)建了達(dá)瑪烯二醇合成酶基因DS的優(yōu)化表達(dá)模塊，與ERG1過表達(dá)模塊一起整合到本實(shí)驗室已有的釀酒酵母底盤 W303TE的基因組 rDNA位點(diǎn)上，得到產(chǎn)達(dá)瑪烯二醇酵母工程菌WDS，達(dá)瑪烯二醇產(chǎn)量為77.05 mg/L，且與W303TE相比達(dá)瑪烯二醇前體物鯊烯的積累量減少了一半。在WDS基礎(chǔ)上對MVA途徑tHMGR、upc2.1、ERG1和ERG9過表達(dá)，通過多拷貝整合和強(qiáng)啟動子表達(dá)強(qiáng)化了達(dá)瑪烯二醇生產(chǎn)途徑的前體供應(yīng)，篩選得到達(dá)瑪