重組人非糖基化促紅細(xì)胞生成素的聚乙二醇定點(diǎn)修飾研究.pdf

1、促紅細(xì)胞生成素(Epo)是一種促進(jìn)紅系造血前體細(xì)胞分化、繁殖的細(xì)胞因子，在臨床上主要用于治療慢性腎功能衰竭(CRF)、艾滋病人及腫瘤病人化療引起的貧血等，療效極為顯著。Epo是一種含有166個(gè)氨基酸的糖蛋白，糖基對(duì)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性維持和體內(nèi)活性至關(guān)重要。目前臨床使用的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEpo)均為中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的糖蛋白，但CHO表達(dá)體系生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長速度快、周期短、培養(yǎng)條件簡單、價(jià)

2、格低廉等優(yōu)點(diǎn)。雖然以大腸桿菌表達(dá)的無糖鏈促紅細(xì)胞生成素(rh-ngEpo)喪失了體內(nèi)生物活性，但是這一點(diǎn)可以通過PEG修飾技術(shù)來彌補(bǔ)。PEG修飾通過減少腎清除、降低免疫原性、減少酶解等改善蛋白藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，提高蛋白藥物的循環(huán)半衰期，增強(qiáng)體內(nèi)藥效，目前已成功用于多種蛋白藥物的長效制劑研發(fā)。
　　 為實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)N末端的定點(diǎn)修飾和提高蛋白修飾后的活性保留，本文采用分子量為20 kDa和30 kDa的單甲氧基聚乙二醇-丙醛(m

3、PEG-ALD)對(duì)rh-ngEpo進(jìn)行修飾。論文考察了各種反應(yīng)條件對(duì)修飾效果的影響，得到了最佳反應(yīng)條件，即在4℃時(shí)，20 mmol/LPB，0.5 mol/L甘露醇，pH6.0溶液中，蛋白濃度為1 mg/mL，PEG/rh-ngEpo摩爾比為10∶1，NaBH3CN/PEG摩爾比為10∶1，反應(yīng)24 h后，單修飾率可達(dá)到55％。用一步離子交換色譜法對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行分離純化，得到純度在95％以上的單修飾產(chǎn)物。
　　 對(duì)單修飾產(chǎn)物理

4、化性質(zhì)和修飾位點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)與原蛋白一致。肽圖分析表明絕大部分的PEG修飾在了蛋白N-末端氨基酸殘基上。ELISA活性分析表明單修飾產(chǎn)物的體外活性比修飾前分別減少了30％和45.6％。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明PEG修飾顯著增強(qiáng)了原蛋白的熱穩(wěn)定性。藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEG提高了rh-ngEpo的代謝穩(wěn)定性。
　　 綜上所述，我們優(yōu)化了mPEG-ALD修飾rh-ngEpo的最佳反應(yīng)條件，有效分離出單修飾產(chǎn)物，確定了偶聯(lián)產(chǎn)物