重組人促紅細(xì)胞生成素對SCI大鼠Akt和p-Akt表達(dá)的影響.pdf

1、前言：
　　脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是臨床脊柱外科的常見病種，發(fā)病率呈逐年增加趨勢。SCI病理過程涉及能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、炎癥發(fā)生、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失、興奮性毒作用等多個環(huán)節(jié)，其病理機(jī)制復(fù)雜。SCI包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷不可逆，無法對其進(jìn)行有效的治療，繼發(fā)性損傷是指傷后幾小時至幾天脊髓損傷局部原來正常的組織發(fā)生自身破壞性病變，如電解質(zhì)失衡、局部血流量改變、Ca2+介導(dǎo)的細(xì)

2、胞損傷、自由基生成、谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性中毒、線粒體功能紊亂、炎性因子生成及細(xì)胞凋亡等，其造成的損害超過原發(fā)性損傷，目前脊髓損傷的研究主要集中在脊髓損傷后脊髓內(nèi)繼發(fā)病理損傷的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)。
　　促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的激素，是促進(jìn)哺乳動物紅系祖細(xì)胞增殖和分化的主要細(xì)胞因子，能夠與EPOR結(jié)合發(fā)揮器官保護(hù)、免疫調(diào)理、抗炎、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)等非促紅細(xì)胞生成作用，最近研究顯示，EPO可在多

3、種細(xì)胞和組織中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。利用動物實驗對EPO在脊髓損傷的作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，EPO能提供神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)作用，臨床試驗也證實了這點。
　　磷脂酰肌醇（-3）激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3 kinase/proteinkinase B，PI3K/Akt)信號通路是體內(nèi)非常重要的一個信號通路，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、葡萄糖代謝及蛋白質(zhì)合成等過程。有研究發(fā)現(xiàn)，EPO能夠通過調(diào)節(jié)P13K/Akt信號通路參

4、與神經(jīng)及心肌保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是EPO激活P13K后，活化Akt，Akt通過磷酸化其下游的底物（如Bad，p53，caspase-9和GSK-3β等），進(jìn)一步激活多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)，包括抗凋亡、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化等。但是在脊髓損傷后，EPO能否通過激活P13K/Akt信號通路調(diào)節(jié)脊髓損傷尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。
　　本實驗選取成年健康Wistar大鼠72只，雌雄不限，按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、

5、脊髓損傷組和重組人促紅細(xì)胞生成素治療組，參照Nystroms壓迫方法制作大鼠脊髓壓迫損傷模型，按照存活時間再分為脊髓損傷6h、12h、1d、3d四個亞組。利用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測Akt、p-Akt蛋白在各組大鼠脊髓損傷部位表達(dá)的變化，探討促紅細(xì)胞生成素治療脊髓損傷的病理作用機(jī)制。
　　材料和方法：
　　一、實驗材料
　　1、實驗動物本實驗選取成年健康Wistar大鼠72只，雌雄不限，由中國

6、醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重在220-250 g。
　　2、主要試劑兔抗大鼠Akt、p-Akt抗體，購自Santa公司;辣根過氧化物酶結(jié)合羊抗兔免疫球蛋白和S-P法免疫組化試劑盒，β-actin，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體均購，購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
　　3、主要儀器電熱恒溫干燥箱;電子分析天平;恒溫水浴箱;低溫冷凍離心機(jī);紫外分光光度計;通用電泳儀;轉(zhuǎn)印儀;正置熒光顯微鏡

7、;-80度深低溫冰箱;恒溫冰凍切片機(jī);Motic Images Advanced3.2圖象分析系統(tǒng)。
　　二、實驗方法
　　1、制備脊髓損傷模型參照Nystrom's壓迫方法制作大鼠脊髓壓迫損傷模型。
　　2、免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠脊髓損傷部位Akt和p-Akt的表達(dá)。
　　3、Western blot方法檢測各組大鼠脊髓損傷部位Akt和p-Akt的表達(dá)。
　　4、圖象分析 Western blot結(jié)果用

8、Chemi Imager5500V2.03軟件掃描，用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的 MOD值。免疫組化結(jié)果用Motic ImagesAdvanced3.2實時圖象分析系統(tǒng)采集照片并進(jìn)行定量分析。
　　5、統(tǒng)計學(xué)處理
　　所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間比較進(jìn)行t檢驗。
　　三、實驗結(jié)果
　?。ㄒ唬〢kt檢測結(jié)果
　　1、免疫組織化學(xué)結(jié)果

9、>　　在假手術(shù)組大鼠的脊髓組織中可發(fā)現(xiàn)大量的Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞，脊髓損傷后Akt陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)迅速降低，在脊髓損傷后24 h時Akt表達(dá)的細(xì)胞數(shù)最低，3d時略有上升，與假手術(shù)組相比顯著降低（P＜0.05）;rHuEPO治療組6h、12h、24h、72h時間點的大鼠脊髓Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞均明顯高于相同時間點的損傷組，顯微圖像結(jié)果分析也證明，rHuEPO治療組大鼠脊髓Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞平均光密度值明顯高于相同時間點的損傷組大鼠。

10、
　　2、Western blot結(jié)果
　　從電泳條帶上可以看出，脊髓損傷后Akt陽性表達(dá)迅速降低，脊髓損傷后24h，Akt表達(dá)降至最低，3d時開始上升，與假手術(shù)組相比顯著降低(P＜0.05);rHuEPO治療組6h、12h、24h、72h時間點的大鼠脊髓Akt蛋白陽性表達(dá)均明顯高于損傷組(P＜0.05)。
　　（二）p-Akt檢測結(jié)果
　　1、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　在假手術(shù)組的脊髓組織中可發(fā)現(xiàn)大量的p-A

11、kt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞，脊髓損傷后Akt陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)迅速降低，在脊髓損傷后12h時，脊髓損傷部位的p-Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)最低，24h時略有回升，3d時p-Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)最高，與假手術(shù)組相比陽性細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P＜0.05);rHuEPO治療組6h、12h、24h、72h時間點的大鼠脊髓p-Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞均明顯高于相同時間點的損傷組大鼠，顯微圖像結(jié)果分析證明，rHuEPO治療組大鼠脊髓p-Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞平

12、均光密度值明顯高于損傷組（P＜0.05)。
　　2、Western blot結(jié)果
　　從電泳條帶上可以看出，脊髓損傷后，脊髓損傷部位的p-Akt的光密度值迅速降低，脊髓損傷后12h的光密度值最低，24h時開始回升，3d時表達(dá)最高，與假手術(shù)組相比顯著降低（P＜0.05);rHuEPO治療組6h、12h、24h、72h時間點的大鼠脊髓p-Akt蛋白陽性表達(dá)均明顯高于相同時間點的損傷組大鼠（P＜0.05）。
　　討論：

13、>　　促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的激素，是促進(jìn)哺乳動物紅系祖細(xì)胞增殖和分化的主要細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，EPO通過使線粒體膜去極化能夠降低caspase-8、caspase-1和caspase-3的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，還有研究報道，EPO能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號激酶與蛋白激酶B，抑制caspase-8、caspase-3和caspase-1激活引起的線粒體細(xì)胞色素C釋放，繼而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作

14、用。
　　研究證實，脊髓繼發(fā)性損傷廣泛存在著細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。絲/蘇氨酸激酶(Akt)又名為蛋白激酶B(PKB)，是生物信號傳遞途徑中的重要因子，并與磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(P13K)構(gòu)成重要的P13K/Akt信號傳導(dǎo)通路，可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，但是其是否參與了細(xì)胞生成素調(diào)節(jié)脊髓損傷的信號通路尚不清楚。
　　在本實驗中，從免疫組化結(jié)果可以看出，假手術(shù)組的脊髓組織中可發(fā)現(xiàn)大量的Akt、p-Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞，而在脊

15、髓損傷后，Akt與p-Akt蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)迅速降低;顯微圖像分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rHuEPO治療組相同時間點的大鼠脊髓Akt、p-Akt蛋白平均光密度值均明顯高于相同時間點的損傷組大鼠。Western blot也得到了相同的結(jié)果，提示上調(diào)損傷部位Akt與p-Akt蛋白的表達(dá)可能是EPO對脊髓損傷發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。
　　結(jié)論：
　　EPO能上調(diào)哮喘SCI大鼠損傷部位Akt和p-Akt的表達(dá)，提示EPO可能通過調(diào)節(jié)Akt和p