副干酪乳桿菌芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶克隆表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)是一種天然生物防腐劑，能抑制多種引起食品腐敗的真菌和細(xì)菌。乳酸菌中的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶能夠?qū)⒈奖彼徂D(zhuǎn)化為苯丙酮酸進(jìn)而還原為苯乳酸，是產(chǎn)苯乳酸的限速酶。
　　根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Lactobacillus casei str.Zhang全基因組序列中的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因設(shè)計引物，以副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei W2）基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)

2、增基因并連接到pMD19-T載體。測序結(jié)果表明:L.paracasei W2芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因長1164bp，與L.casei str.Zhang的基因序列相似性為100％。
　　分析和預(yù)測副干酪乳桿菌(L.paracasei W2)芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和特性，以指導(dǎo)其生物學(xué)功能的實驗研究。對編碼蛋白進(jìn)行疏水性分析、磷酸化位點預(yù)測、二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測并構(gòu)建分子進(jìn)化樹。結(jié)果表明該基因編碼387個氨基酸，理論相

3、對分子質(zhì)量是41961.2Da，等電點為6.03，具有完整的保守結(jié)構(gòu)域和保守功能位點，該蛋白有兩個跨膜螺旋區(qū)。與干酪乳桿菌的進(jìn)化關(guān)系最近。
　　將芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因連入表達(dá)載體，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，優(yōu)化誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示出42kD的特征性蛋白條帶，與預(yù)期大小一致。對重組芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，其酶活測定的最適pH為6.8、最適溫度為50