表達(dá)TNFR-Fc的CHO-GS細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)化及流加工藝設(shè)計(jì).pdf

1、腫瘤壞死因子受體-Fc抗體融合蛋白TNFR-Fc在治療風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面具有很好的療效，但是由于對(duì)TNFR-Fc日益增長(zhǎng)的需求與其價(jià)格昂貴、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體融合蛋白能力低的矛盾限制了其在治療和診斷方面的使用。因此，針對(duì)表達(dá)TNFR-Fc抗體融合蛋白的CHO-GS細(xì)胞，設(shè)計(jì)一種成本較低的無(wú)血清培養(yǎng)基，并且建立經(jīng)濟(jì)高效的流加培養(yǎng)工藝，對(duì)于TNFR-Fc抗體融合蛋白成功邁向產(chǎn)業(yè)化很重要。
　　 ㈠CHO-GS細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)

2、基的優(yōu)化：⑴氨基酸濃度的優(yōu)化。通過(guò)對(duì)CHO-GS細(xì)胞在商業(yè)化的EX-CELLTM302培養(yǎng)基中的氨基酸代謝分析，優(yōu)化基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中的氨基酸濃度，結(jié)果如下：Asp，20 mg/l；Thr，180 mg/l；Ser，25 mg/l；Glu，40 mg/l；Cys，30 mg/l；Val，50 mg/l；Met，50 mg/l；Ile，50 mg/l；Leu，60 mg/l；Tyr，40 mg/l；Phe，60 mg/l；Lys

3、，60 mg/l；His，30 mg/l；Trp，30 mg/l；Pro，70 mg/l；⑵Plackett-Burman篩選主要影響因素。依據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，評(píng)估乙醇胺，亞硒酸鈉，腐胺，氫化可的松，脂類，丙酮酸鈉，谷胱甘肽，氯化膽堿，D-泛酸鈣，葉酸，煙酰胺，鹽酸吡咯醛，核黃素，鹽酸硫胺，氯鈷胺素和肌醇十七中因子對(duì)CHO-GS細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明腐胺，乙醇胺，脂類，丙酮酸鈉，氯化膽堿及泛酸

4、鈣對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有積極作用，同時(shí)腐胺(p<0.01)對(duì)蛋白表達(dá)也有重要的促進(jìn)作用；而亞硒酸鈉，抗壞血酸，谷胱甘肽，核黃素和肌醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制影響；⑶中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定重要因子的最優(yōu)濃度。通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了最大抗體生產(chǎn)量時(shí)脂類、腐胺和檸檬酸鐵銨的濃度，分別為：0.5×，1.5 mg/l和0.75 mM；⑷通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的CHO-SFM，最大細(xì)胞密度為3.5×106/ml，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了84％：TNFR-Fc終產(chǎn)量為85.5

5、9 mg/l，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了9.3倍。
　　 ㈡CHO-GS細(xì)胞在CHO-SFM與EX-CELLTM302培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)的生長(zhǎng)代謝及抗體表達(dá)特性。結(jié)果表明：細(xì)胞在CHO-SFM與EX-CELLTM302中獲得的最大細(xì)胞密度分別為3.73×106 cells/ml和3.64×106cells/ml，兩者沒(méi)有很大差別；CHO-SFM中的細(xì)胞比生產(chǎn)率(7.97mg/109cell/day)較EX-CELLTM302(6.70 m

6、g/109cell/day)提高了19％；CHO-SFM的終抗體產(chǎn)量(90.95 mg/l)較EX-CELLTM302(76.95 mg/l)提高了18％；兩者的唾液酸含量分別為61.8μg/mg和62.1μg/mg，均符合TNFR-Fc合格的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 ㈢CHO-GS細(xì)胞在CHO-SFM培養(yǎng)基中的適應(yīng)性及穩(wěn)定性分析。細(xì)胞在CHO-SFM中能夠很快地適應(yīng)，連續(xù)傳代25天，細(xì)胞依然能夠很好地增殖并且保持較高的活力，比生長(zhǎng)速率μ基