酵母全細胞不對稱還原法合成光學純α-羥基酸及其脫氫酶特性的研究.pdf

1、生物催化以其高效的立體、位置和化學選擇性成為合成光學純手性化合物的重要手段。光學純α-羥基酸類手性砌塊是重要的精細化工中間體和手性藥物前體。(R)-扁桃酸結(jié)構(gòu)單元是其中最具有應用價值的代表,它不僅是半合成青霉素、頭孢菌素、減肥藥物和抗腫瘤藥物等多種手性藥物的重要砌塊,還是應用廣泛的手性拆分劑。微生物不對稱還原途徑以其理論產(chǎn)率高、操作簡便成為合成此類化合物最直接和可行的方法。但目前仍存在催化劑穩(wěn)定性差、全細胞傳質(zhì)阻力和終產(chǎn)物濃度低等問題。

2、本論文以(R)-扁桃酸為模型產(chǎn)物,以克服生物催化反應中的主要限制因素、提高生物催化效率為目標,通過生物催化劑篩選、合理設(shè)計生物催化過程、對底物進行修飾和采取原位分離策略等方法使微生物不對稱還原潛手性化合物合成(R)-扁桃酸類結(jié)構(gòu)單元的效率明顯提高。此外,對全細胞催化劑內(nèi)起關(guān)鍵作用的醇脫氫酶進行了純化和酶學性質(zhì)研究,為其應用和進一步改造提供指導。主要結(jié)果如下:
　　 (1)以苯甲酰甲酸為模型α-酮酸底物,針對底物極性和酸性導致的生

3、物催化劑穩(wěn)定性差的問題,采取逐步提高底物濃度的連續(xù)分批選擇方法獲得了具有較好操作穩(wěn)定性的全細胞催化劑葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus GIM2.105)。該催化劑在連續(xù)分批轉(zhuǎn)化20批后仍具有較高的催化活性,4℃儲存5周對催化劑的活性影響很小。對此催化劑的底物特異性進行了研究,發(fā)現(xiàn)它對4種苯甲酰甲酸的苯環(huán)取代衍生物也具有很好的催化效果,產(chǎn)物(R)-扁桃酸衍生物的轉(zhuǎn)化率和對映體過量值(ee值)分別保持在90％

4、和95％以上。
　　 (2)利用硫酸銨鹽析、苯基疏水層析和凝膠過濾等純化了S.ellipsoideus胞內(nèi)D-扁桃酸脫氫酶,純化倍數(shù)為46倍。該酶的亞基分子量為44 kDa,催化還原反應的最佳輔酶是NADPH,這些性質(zhì)與其他來源的D-扁桃酸脫氫酶不同。S.ellipsoideus D-扁桃酸脫氫酶催化還原反應的最適pH和溫度分別為pH5.5和30℃,在pH5.5-pH8.0和溫度低于30℃時保持相對穩(wěn)定。
　　 (3)研

5、究了影響S.ellipsoideus全細胞不對稱還原苯甲酰甲酸的主要因素,確定最適反應條件為:限氧條件下、pH7.5、溫度35℃、葡萄糖作為輔助底物、其最適濃度是10 g/L。在此條件下,當?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時,轉(zhuǎn)化48 h后,產(chǎn)物(R)-扁桃酸的轉(zhuǎn)化率和ee值分別達到90％和99％以上。在監(jiān)測S.ellipsoideus不對稱還原苯甲酰甲酸的進程時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化初期12 h無產(chǎn)物生成,即存在轉(zhuǎn)化初期停滯現(xiàn)象。通過研究關(guān)鍵醇脫氫酶活

6、性、輔助底物和全細胞催化劑的傳質(zhì)阻力等影響因素,確定全細胞對底物/產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力是導致此反應時間長的原因。通過改變底物結(jié)構(gòu),即將原α-酮酸底物變?yōu)棣?酮酯底物,可以使不對稱還原反應的時間明顯降低。
　　 (4)通過篩選更適合催化α-酮酯底物不對稱還原的生物催化劑以及合理設(shè)計反應過程進一步提高了此類化合物的生物合成效率。以苯甲酰甲酸甲酯為模型α-酮酯底物,通過對反應特異性限制因素(如底物和產(chǎn)物的化學穩(wěn)定性等)的研究,發(fā)現(xiàn)底物和產(chǎn)物

7、的水解是此反應的主要限制因素。通過初步選擇生物催化體系的pH值將底物和產(chǎn)物的水解損失降至最低。在此較適pH值下,對實驗室保藏的37株酵母菌進行篩選,獲得了對底物苯甲酰甲酸甲酯具有較高催化活性和立體選擇性的全細胞催化劑釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae.AS2.1392)。研究了其催化不對稱還原α-酮酯的主要影響因素,確定最適轉(zhuǎn)化條件為:pH6.5、溫度25℃、葡萄糖作為輔助底物、其最適濃度是20 g/L。在此條件

8、下,當?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時,反應在1.5 h之內(nèi)結(jié)束,產(chǎn)物(R)-扁桃酸甲酯的產(chǎn)率和ee值分別達到92.4％和95％。
　　 (5)研究了底物和產(chǎn)物濃度對S.cerevisiae全細胞不對稱還原α-酮酯的影響,建立了底物和產(chǎn)物抑制模型。當?shù)孜餄舛葹?3 mmol/L時反應初速度最大,隨著底物濃度的升高或降低反應初速度降低;產(chǎn)物濃度的增加使反應初速度呈下降趨勢,當產(chǎn)物濃度高于100 mmol/L時,反應初速度迅速下降。為