提高酵母細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)氧化還原制備手性醇效率的研究.pdf

1、光學(xué)活性仲醇是重要的醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品中間體，光學(xué)純苯基乙二醇(PED)是其中的重要代表，廣泛用于手性藥物、農(nóng)藥和液晶材料的合成。與化學(xué)合成法合成手性化合物相比，生物催化劑在位置、化學(xué)和立體選擇性上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。其中，微生物去消旋和不對(duì)稱(chēng)還原法由于其理論最大得率100％和操作簡(jiǎn)便已經(jīng)成為當(dāng)今生物催化中前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)內(nèi)容。但這兩類(lèi)反經(jīng)常遇到的幾個(gè)共性問(wèn)題是底物濃度低，輔酶循環(huán)效率低和催化劑不穩(wěn)定。本論文以酵母細(xì)胞催化不對(duì)稱(chēng)氧化還原反應(yīng)高效合

2、成光學(xué)純苯基乙二醇為目標(biāo)，針對(duì)近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）催化PED去消旋和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不對(duì)稱(chēng)還原α-羥基苯乙酮反應(yīng)的瓶頸，采取過(guò)程控制和介質(zhì)工程手段明顯提高了其反應(yīng)效率。此外，還揭示了C parapsilosis細(xì)胞代謝D-木糖（戊糖）偶聯(lián)去消旋苯基乙二醇過(guò)程的作用機(jī)理。這些發(fā)現(xiàn)不僅進(jìn)一步豐富了還原酶手性生物催化理論，而且有助于合成其他精細(xì)化學(xué)品。主要結(jié)果如

3、下：
　　 (1)以C.parapsilosis細(xì)胞催化PED去消旋為模式反應(yīng)，對(duì)可能限制細(xì)胞催化活性的因素進(jìn)行了系統(tǒng)考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物濃度高于25g/l或產(chǎn)物濃度高于17.5g/l對(duì)該反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。較高的底物或產(chǎn)物濃度（如超過(guò)30g/l）導(dǎo)致細(xì)胞死亡率大于18.3％。此外，在高底物濃度下（如30g/l）NADPH再生也是限制該反應(yīng)效率的因素之一。
　　 (2)運(yùn)用樹(shù)脂原位底物補(bǔ)料和產(chǎn)物移除“二合一”策略提高去

4、消旋反應(yīng)的效率。大孔樹(shù)脂H103由于吸附容量高和對(duì)反應(yīng)促進(jìn)最明顯被選作吸附材料。最佳反應(yīng)條件如下：pH8，溫度30℃，細(xì)胞120g/l，樹(shù)脂72g/l，轉(zhuǎn)速150r/min。在該條件下30g/lPED反應(yīng)48h后，產(chǎn)物(S)-PED光學(xué)純度和得率分別達(dá)到99.2％和93.6％?；谕ㄟ^(guò)異構(gòu)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)生物催化去消旋的特點(diǎn)，提出一種合理運(yùn)用樹(shù)脂原位底物補(bǔ)料和產(chǎn)物移除“二合一”策略的方法。該新方法可使C.parapsilosis催化50g/l底

5、物反應(yīng)90h后，產(chǎn)物e.e值和得率分別高達(dá)99.3％和92.0％。
　　 (3)C.parapsilosis催化苯基乙二醇去消旋分批連續(xù)反應(yīng)中，添加D-木糖有利于細(xì)胞代謝活性的恢復(fù)，但對(duì)催化去消旋關(guān)鍵反應(yīng)的(S)-羰基還原酶活力無(wú)影響。在證實(shí)細(xì)胞內(nèi)存在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的基礎(chǔ)上，通過(guò)磷酸戊糖途徑抑制試驗(yàn)和直接測(cè)定胞內(nèi)NADPH含量相結(jié)合的方法，揭示了C.parapsilosis細(xì)胞代謝D-木糖偶聯(lián)去消旋苯基乙二醇過(guò)程的作用

6、機(jī)理：D-木糖先后經(jīng)過(guò)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的還原和氧化反應(yīng)生成木酮糖，再經(jīng)木酮糖激酶生成5-磷酸木酮糖并由此進(jìn)入磷酸戊糖途徑。通過(guò)磷酸戊糖途徑中間代謝產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸的兩步脫氫反應(yīng)產(chǎn)生大量NADPH用于去消旋PED，提高反應(yīng)效率和催化系統(tǒng)的穩(wěn)定性。此外，萃取轉(zhuǎn)化（樹(shù)脂/緩沖液體系）和輔酶再生（添加D-木糖）相結(jié)合的策略，不但可以解除底物/產(chǎn)物抑制，還能提高生物催化劑的可持續(xù)性。
　　 (4)通過(guò)靶向反應(yīng)定

7、向篩選成功獲得一株高立體選擇性(e.e＞99.9％)不對(duì)稱(chēng)還原α-羥基苯乙酮合成(R)-PED的酵母S.cerevisiae JUC15。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?g/l時(shí)游離細(xì)胞重復(fù)使用40次，產(chǎn)物得率和光學(xué)純度無(wú)明顯降低。該催化劑使用廉價(jià)的蔗糖作為輔助底物用于輔酶再生，可在相當(dāng)寬的pH范圍內(nèi)(4-9)催化α-羥基苯乙酮。在所有考察條件下，產(chǎn)物e.e值始終保持大于99.9％。當(dāng)α-羥基苯乙酮濃度低于其溶解度(11.4g/l)時(shí)，產(chǎn)物抑制是不對(duì)稱(chēng)還

8、原反應(yīng)的主要瓶頸。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂谄淙芙舛?，尤其是超過(guò)20g/l，產(chǎn)物抑制和催化劑失活是引起(R)-苯基乙二醇得率降低的主要原因。此外，S.cerevisiae細(xì)胞催化部分產(chǎn)物降解。為克服這些缺點(diǎn)，采取緩沖液和水不溶性有機(jī)溶劑組成的原位分離的策略。通過(guò)測(cè)定不同有機(jī)溶劑對(duì)底物/產(chǎn)物分配系數(shù)和對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響，篩選出對(duì)此反應(yīng)具有較好促進(jìn)作用的有機(jī)溶劑鄰苯二甲酸二丁酯。在合適的相比例下，產(chǎn)物濃度達(dá)到20.7g/l，明顯高于目前已報(bào)道的其他