解淀粉芽孢桿菌YP--2產(chǎn)γ--聚谷氨酸的pH調控及變溫發(fā)酵研究.pdf

1、γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)作為一種高分子生物產(chǎn)品，擁有諸多優(yōu)良特性，顯示出廣闊的研究價值和應用前景，是當前研究熱點之一。本研究以產(chǎn)γ-PGA菌株YP-2為對象，考察了pH和溫度對其產(chǎn)γ-PGA的影響，并通過pH調控和變溫發(fā)酵實現(xiàn)了γ-PGA產(chǎn)量較大幅度的提高。
　　鑒定了菌株YP-2及其發(fā)酵產(chǎn)物。通過對菌株YP-2的菌體、菌落形態(tài)觀察以及生理生化特征對比，結合16S rDNA序列測定結果以及

2、gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果，確定菌株YP-2為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。以MSG發(fā)酵培養(yǎng)基作為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，采用乙醇分離提取法處理發(fā)酵液，對提取物進行了紅外光譜(FTIR)分析，確定菌株YP-2發(fā)酵產(chǎn)物為γ-PGA，提取純度為60.47％。對不同pH條件下提取的γ-PGA進行鈉原子吸收光譜(AAS)分析和灰分差異分析，確定從發(fā)酵液分離提取的γ-PGA是以鈉鹽的形式存在。

3、　　研究了菌株YP-2產(chǎn)γ-PGA的發(fā)酵特性。以是否含有谷氨酸鈉作為標準，設置兩種發(fā)酵培養(yǎng)基（不含谷氨酸鈉的Non-MSG培養(yǎng)基以及含有谷氨酸鈉的MSG發(fā)酵培養(yǎng)基），在分批發(fā)酵方式下考察了谷氨酸鈉對γ-PGA發(fā)酵的影響。試驗結果表明，Non-MSG發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體干重不斷增加，在60h達到最大值8.08g/L;MSG發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體干重在42h達到最大值8.47g/L，隨后減少至60h的6.37g/L。Non-MSG發(fā)酵培養(yǎng)基在48h達

4、到最大產(chǎn)量6.51g/L;MSG發(fā)酵培養(yǎng)基的γ-PGA產(chǎn)量在45h達到最大值25.24g/L，谷氨酸鈉表觀轉化率為63.1％。谷氨酸鈉的加入使得相同發(fā)酵條件下γ-PGA產(chǎn)量大幅度提高，是不含谷氨酸鈉發(fā)酵產(chǎn)量的3.88倍。
　　研究了分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵對菌株YP-2產(chǎn)γ-PGA的影響。以γ-PGA產(chǎn)量、谷氨酸鈉表觀轉化率、谷氨酸鈉真實轉化率為指標，在MSG發(fā)酵培養(yǎng)基中進行γ-PGA發(fā)酵生產(chǎn)。試驗結果發(fā)現(xiàn)，分批發(fā)酵表觀轉化率與真實

5、轉化率均為63.1％，γ-PGA產(chǎn)量為25.24g/L;補料分批發(fā)酵中，24h是谷氨酸鈉補料的最適時間，當補料100g/L時有最高表觀轉化率62.26％、最高真實轉化率60.9％，γ-PGA產(chǎn)量為32.38g/L。補料分批發(fā)酵的γ-PGA產(chǎn)量雖然高于分批發(fā)酵，但是其表觀轉化率、真實轉化率均低于分批發(fā)酵，發(fā)酵效率較低，因此選擇分批發(fā)酵作為菌株YP-2產(chǎn)γ-PGA的發(fā)酵方式。
　　研究了調控pH對菌株YP-2產(chǎn)γ-PGA的影響。初始p

6、H影響γ-PGA產(chǎn)量，選用不同的初始pH值進行γ-PGA發(fā)酵，當初始pH為7-7.5時，γ-PGA產(chǎn)量較高，最大值為25.24g/L。試驗中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中穩(wěn)定的pH有利于γ-PGA生產(chǎn)，當發(fā)酵進行到30-45h，pH保持穩(wěn)定在7.0-7.5之間，此時γ-PGA產(chǎn)量較高。在MSG發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度K2HPO43H2O/KH2PO4緩沖鹽以保持發(fā)酵過程中pH的穩(wěn)定性。當加入的K2HPO43H2O/KH2PO4緩沖鹽濃度為220mM/

7、60mM，γ-PGA產(chǎn)量達到最大值38.39g/L，比不加緩沖鹽提高了521％。最終確定發(fā)酵過程中最佳pH控制范圍為7.09-7.35。
　　研究了不同溫度下菌株YP-2產(chǎn)γ-PGA的恒溫發(fā)酵過程。在pH調控(7.09-7.35)條件下進行恒溫發(fā)酵，不同溫度(31、33、35、37、39℃)發(fā)酵產(chǎn)生的γ-PGA最高產(chǎn)量及對應時間均有差異，37℃達到最高產(chǎn)量38.39g/L，對應發(fā)酵時間34h。試驗結果表明γ-PGA的比生產(chǎn)速率各有

8、快慢，發(fā)酵過程的不同階段有著不同的最適溫度，恒溫發(fā)酵不能使菌體保持最高的生產(chǎn)速率。
　　提出并進行了菌株YP-2產(chǎn)γ-PGA的變溫發(fā)酵條研究。根據(jù)恒溫發(fā)酵過程分析，結合γ-PGA發(fā)酵過程的動力學曲線，以不同溫度下不同階段γ-PGA的最高比生產(chǎn)速率為指標，制定菌株YP-2產(chǎn)γ-PGA的階梯式溫度調節(jié)控制方案(0～4h，35℃;4～7h，31℃;7～10h，33℃;10～26h，37℃;26～60h，31℃)。采用此變溫發(fā)酵方案，γ-