解淀粉芽孢桿菌jy-1產細菌素發(fā)酵條件研究——畢業(yè)論文

1、<p>　　湖 南 農 業(yè) 大 學</p><p>　　全日制普通本科生畢業(yè)論文</p><p>　　解淀粉芽孢桿菌JY-1產細菌素發(fā)酵條件研究</p><p>　　OPTIMIZATION OF FERMENTATION CONDITIONS FOR PRODUCTION OF BACTERIOCIN BY BACILLUS AMYLOLIQUEFACI

2、ENS JY-1</p><p><b>　　學生姓名：</b></p><p><b>　　學號：</b></p><p>　　年級專業(yè)及班級： 食質 </p><p>　　指導老師及職稱： </p><p>　　學院：食品科學技術學院</p><p

3、><b>　　湖南·長沙</b></p><p><b>　　提交日期： 年 月</b></p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言4</b></p><p><b>　　2材料與方

4、法7</b></p><p><b>　　2.1試驗材料7</b></p><p>　　2.1.1 菌種7</p><p><b>　　2.1.2器具7</b></p><p>　　2.1.3培養(yǎng)基7</p><p>　　2.1.4儀器與設備7<

5、/p><p><b>　　2.2試驗方法8</b></p><p>　　2.2.1 菌種的活化8</p><p>　　2.2.2 抑菌方法8</p><p>　　2.2.3 外源碳源對細菌素產量的影響8</p><p>　　2.2.4外源氮源對細菌素產量的影響8</p><

6、;p>　　2.2.5培養(yǎng)溫度對細菌素產量的影響9</p><p>　　2.2.6 轉速對細菌素產量的影響9</p><p>　　2.2.7發(fā)酵工藝的正交化設計9</p><p>　　2.2.8數(shù)據分析9</p><p>　　3 結果和分析10</p><p>　　3.1外源碳源對細菌素產量的影響1

7、0</p><p>　　3.2外源氮源對細菌素產量的影響10</p><p>　　3.3培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度對細菌素產量的影響10</p><p>　　3.4轉速對細菌素產量的影響11</p><p>　　3.5正交實驗結果11</p><p>　　3.6方差分析確定最佳實驗結果12</p><

8、p><b>　　4 結論15</b></p><p><b>　　參考文獻16</b></p><p><b>　　致謝19</b></p><p>　　解淀粉芽孢桿菌JY-1產細菌素發(fā)酵條件研究</p><p>　　摘要：本研究以單增李斯特細菌54002作為指示

9、菌。采用杯碟法作為抑菌試驗方法，對解淀粉芽孢桿菌JY-1所產細菌素的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。由正交試驗設計得出產細菌素最佳條件為：0.5%含量的牛肉膏，1%含量的可溶性淀粉，在33℃，轉速250r/min下培養(yǎng)22 h。在該發(fā)酵條件下，檢測出來的細菌素的抑菌圈大小為11.1mm。</p><p>　　關鍵詞:細菌素；發(fā)酵條件優(yōu)化；正交設計</p><p>　　Optimization of F

10、ermentation Conditions for Production of Bacteriocin by Bacillus amyloliquefaciens JY-1</p><p>　　Abstract:By using Listeria monocytogenes54002 as the indicator bacteria, the bacterial inhibition zone diamete

11、r was considered as an indicator, and the fermentation conditions ofbacteriocin produced by B. amyloliquefaciensJY-1 were optimized. The experiment was designed by orthogonal design method, and the best experimental grou

12、p was 4 groups: 0.5% beef extract, 1% soluble starch, 33 ℃, 250r/min. Under this condition, the inhibition zone size was 11.1mm.</p><p>　　Key words: bacteriocin;optimization of fermentation condition;orthogo

13、nal design.</p><p><b>　　1.前言</b></p><p>　　細菌素是一種細菌在代謝過程中通過核糖體的作用合成的一種具有抑制親緣性菌種活性作用的多肽或前體多肽類物質，對相對近緣性菌種呈現(xiàn)較窄的抑菌譜[1]該物質能抑制靶細胞中肽聚糖的生物合成，抑制與核糖體結合的蛋白質合成，或直接降解靶細胞DNA，實現(xiàn)其抑菌作用[2]。</p>

14、<p>　　部分研究表明，分子基團的相互作用使細菌素和細胞的相互作用更容易進行，從而提高細菌素的抑菌效果[3]該機制成功地闡明了Nisin和美沙西汀的作用機理[4]。</p><p>　　現(xiàn)代細菌素是可以用于肉類工業(yè)、奶制品加工業(yè)、釀酒與糧食加工等領域等的抑制菌種的生物制品[5]。可用于防治肉類等食品中有害菌群的生長，也可用于其他各類食品加工工業(yè)的生物菌種防治[6]。</p><p&

15、gt;　　現(xiàn)代細菌素的運用還不是非常廣泛硝酸鹽被廣泛應用于肉制品中，以防止梭菌的存在，使食物容易變質，但對人體健康非常有害，甚至危及生命。而細菌素則擁有高效，安全等特點，急需我們去運用[7]。最新的細菌素在食品中的應用是乳鏈菌肽，在美國，已經被法律列為可使用的食品添加劑[8]。而解淀粉芽孢桿菌是現(xiàn)代實驗和科研檢測用的較為成熟的一種實驗菌種，故在生產發(fā)酵細菌素的研究中，可通過各項因素（碳源、氮源、生長因子、溫度、水分、ph等）的各項改變產

16、生的細菌素產量的不同，運用正交設計法來研究最為高產的生長條件，來起到提高細菌素產量的目的。</p><p>　　抗菌肽是昆蟲體內產生的一種抗菌堿性多肽[9]。該肽的分子量k可以大致約為3000～8000，由30～70個氨基酸殘基組成。這些活性肽大多具有較強的堿性、熱穩(wěn)定性和廣譜抗菌性能。世界上第一個被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽的是1980年由瑞典科學家G.BoMand等已注入大腸桿菌和大腸桿菌誘導產生抗菌肽PuPui蛹，稱為抗

17、菌肽。</p><p>　　細菌中有4種:Bacitracin、S（短桿菌肽S）、多粘菌素E（多粘菌素E）和乳酸桿菌（NISIN）。它是一種耐酸物質，即使在低pH環(huán)境下，如胃，它可以抑制革蘭氏陽性細菌，如梭形芽孢桿菌和李斯特菌?？咕牡漠a率和活性受溫度、培養(yǎng)基組成等環(huán)境條件的影響很大。因此，發(fā)酵條件的研究是非常重要的[ 10 ]。</p><p>　　正交試驗設計（正交試驗設計）是一種研究

18、多因素、多層次的試驗設計方法?；谡恍裕瑥木C合測試中選取一些有代表性的點。這些代表點具有“均勻分散和均勻比”的特點。日本著名統(tǒng)計學家Taguchi Xuanichi列出了通過正交實驗選擇的水平組合，稱為正交陣列。例如，需要三個因素和三個水平的實驗。根據綜合實驗的要求，應進行3^3＝27組合，各組合的重復尚未考慮。根據L9（34）正交表，需要9個實驗，并根據L18（35）正交表進行18個實驗，這明顯地減少了工作量。因此，正交試驗設計在許

19、多領域得到了廣泛的應用。</p><p>　　L是正交表中的代碼，n是測試次數(shù)，t是水平，C是列的數(shù)目，即可以安排的因素的數(shù)量。例如，L9（34）表明需要9個實驗，最多可以觀察到4個因素。每個因素是3水平。正交表中每個列的水平數(shù)也不相等。我們稱之為混合正交表，如L8（4×2）。在該表的5列中，1列為4列，4列為2級[11]。</p><p>　　芽孢桿菌（Bacillus spp

20、.）生長迅速、營養(yǎng)要求簡單、抗逆性強（芽孢擁有非常強的抗逆性，可耐高溫，高壓，高滲透壓等），可以生產多肽抗生素，并且可以產生具有細菌作用的酶。利用芽孢桿菌及其代謝產物是防治真菌病害最安全、有效、最有前途的天然生物制劑。</p><p>　　解淀粉芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌屬中枯草芽孢桿菌種中的解淀粉枯草芽孢桿菌亞種，也是我們現(xiàn)代實驗室中常用于研究的菌種，屬于格蘭氏陽性桿菌。它作為一個用于研究的菌種，具有易培養(yǎng)，生產量

21、大，實驗效果明顯的特點。</p><p>　　在實驗室初期，對真菌的種類進行分離鑒定，篩選出對霉菌生長和孢子萌發(fā)有較強抑制作用的孢子菌株。與傳統(tǒng)的化學防腐劑相比，它們所分泌的抗菌物質在抑制霉菌生長方面更有效。</p><p><b>　　2.材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p

22、><p><b>　　2.1.1 菌種</b></p><p>　　解淀粉芽孢桿菌JY-1及指示菌單增李斯特菌54002，本實驗室保存。</p><p><b>　　2.1.2器具</b></p><p>　　黃漿水（購自湖南農業(yè)大學濱湖農貿市場），培養(yǎng)皿，燒杯，接種針，酒精燈，試管，牛津杯，1.5mL

23、離心管，移液槍，塑料瓶（均由湖南農業(yè)大學食品科技學院實驗室提供）</p><p><b>　　2.1.3 培養(yǎng)基</b></p><p>　　可溶性淀粉、牛肉膏、瓊脂（NA）培養(yǎng)基：購自北京陸橋技術有限責任公司。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司</p><p>　　2.1.4 儀器與設備</p><p>&l

24、t;b>　　表1 儀器與設備</b></p><p>　　Table 1 Instruments and equipment</p><p><b>　　2.2方法</b></p><p>　　2.2.1菌種的活化</p><p>　　將解淀粉芽孢桿菌JY-1（B.amyloliquefaciens

25、 JY-1）菌種接入無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h。</p><p>　　2.2.2 抑菌試驗方法</p><p>　　取活化后的單增李斯特菌菌液0.1mL與100mL融化后的并保持在50℃后左右的瓊脂培養(yǎng)基進行混合，然后倒平板，待培養(yǎng)基凝固后放置無菌牛津杯，在牛津杯中加入0.2 mL JY-1的發(fā)酵上清液，然后在4℃冰箱中擴散4 h以上。取出平板后于37℃培養(yǎng)12 h，之后觀

26、察抑菌圈大小，測量抑菌圈大小，并做記錄。</p><p>　　2.2.3外源碳源對產細菌素的影響</p><p>　　以黃漿水代替培養(yǎng)基中的水，分別加入終濃度為2%的碳源（碳源種類：葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖），以不加碳源的黃漿水培養(yǎng)基作為對照。以3%接種量接種活化后的芽孢桿菌JY-1，在150 rpm轉速下，37℃培養(yǎng)22 h。將培養(yǎng)后的菌液6000 r/min離心3

27、min，取上清液進行抑菌試驗，測定抑菌圈直徑。</p><p>　　2.2.4外源氮源對產細菌素的影響</p><p>　　以黃漿水代替培養(yǎng)基中的水，分別加入終濃度為0.5%的氮源（氮源種類：牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、酵母膏），以不加氮源的黃降水培養(yǎng)基作為對照。以3%接種量接種活化后的芽孢桿菌JY-1，在150 r/min轉速下，37℃培養(yǎng)22 h。將培養(yǎng)后的菌液6000 r/min離心3

28、min，取上清進行抑菌試驗，測定抑菌圈直徑大小。</p><p>　　2.2.5 培養(yǎng)溫度對產細菌素的影響</p><p>　　將滅菌后的黃漿水按照以3%接種量接種活化后的芽孢桿菌JY-1，然后在不同的溫度（28℃、33℃、38℃）下150 rpm培養(yǎng)22h（恒溫培養(yǎng)振蕩器中），取培養(yǎng)液進行離心（6000r/min下3min）。取菌液的上清液進行抑菌試驗，測定抑菌圈大小。</p>

29、;<p>　　2.2.6 轉速對產細菌素的影響</p><p>　　將滅菌后的黃漿水按照3%接種量接種活化后的芽孢桿菌JY-1，然后在37℃，不同的轉速r/min（170、210、250）下培養(yǎng)22 h，取將培養(yǎng)液進行離心（6000r/min下3min）。取菌液的上清液進行抑菌試驗，測定抑菌圈大小。</p><p>　　2.2.7 正交試驗優(yōu)化</p><

30、p>　　發(fā)酵工藝的正交優(yōu)化設計采用4個關鍵因子：牛肉膏（x1，3水平）、可溶性淀粉（x2，3水平）、溫度（x3，3水平）、轉速（x4，3水平）進行混合正交設計，見表2。</p><p>　　表2 設計因素及水平表</p><p>　　Table 2 Factors and levels in Box-Behnken central composite design</p>

31、<p><b>　　2.2.8數(shù)據分析</b></p><p>　　采用SPSS 17進行數(shù)據分析，并將處理好的結果進行整理并分析。</p><p><b>　　3.結果和分析</b></p><p>　　3.1 外源碳源對產細菌素的影響</p><p>　　在黃漿水中加入2%不同種類

32、的碳源，培養(yǎng)JY-1后，其發(fā)酵液的抑菌圈大小見圖1。</p><p>　　圖1 外源添加不同碳源抑菌圈直徑大小</p><p>　　Fig.1 The diameter of different carbon source inhibition zone was added.</p><p>　　從圖1中可以看出，添加一定濃度的碳源，均能促進細菌素的產生。其中添加可

33、溶性淀粉培養(yǎng)時，JY-1的細菌素產量最高，故選用可溶性淀粉作為最佳碳源。</p><p>　　3.2 外源氮源對產細菌素的影響</p><p>　　在黃漿水中加入2%不同種類的氮源，培養(yǎng)JY-1后，其發(fā)酵液的抑菌圈大小見圖2。</p><p>　　圖2 外源添加不同碳源抑菌圈直徑大小</p><p>　　Fig.2 The diameter

34、 of different carbon source inhibition zone was added.</p><p>　　從圖2中可以看出，添加不同種類的氮源，均能促進細菌素的產生。其中添加牛肉膏進行解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)，細菌素的產量最高，故選用牛肉膏作為最佳氮源。</p><p>　　3.3培養(yǎng)溫度對產細菌素的影響</p><p>　　將JY-1接種于黃漿

35、水中，于不同溫度下培養(yǎng)，抑菌圈大小見圖3。</p><p>　　圖3 不同溫度下抑菌圈直徑大小</p><p>　　Fig. 3 The diameter of the antibacterial ring at different temperatures.</p><p>　　從圖3中可以看出，溫度對細菌素產量有較顯著的影響，在33℃下細菌素產量最高。<

36、/p><p>　　3.4培養(yǎng)轉速對產細菌素的影響</p><p>　　將JY-1接種于黃漿水中，在不同轉速下進行培養(yǎng)，其培養(yǎng)液的抑菌圈直徑大小見圖4。</p><p>　　圖4 不同轉速抑菌圈直徑大小</p><p>　　Fig. 4 the diameter of the antibacterial ring at different spe

37、ed.</p><p>　　從圖4中可以看出，溫度對細菌素產量有較顯著的影響，在210r/min下產量最高。</p><p>　　3.5 正交試驗結果</p><p>　　本試驗以提高細菌素產量為目標，以確定最適宜的反應條件為目的。影響本反應產量的因素有氮源含量、碳源含量、轉速和溫度等。</p><p>　　將本試驗范圍分別定為：牛肉膏（x1

38、，3水平）、可溶性淀粉（x2，3水平）、溫度（x3，3水平）、轉速（x4，3水平）進行正交設計。各因子的取值范圍分別為：0.1%≤x1≤0.9%、1%≤x2≤3%、28℃≤x3≤38℃、170 r/min≤x4≤250 r/min再從每一試驗范圍選取3個水平，即可設計成4因子3水平實驗方案，見表1。取反應進行到22h時的樣品分析，其實驗結果見表2。</p><p>　　表3 L9 ( 34 )正交實驗結果表&l

39、t;/p><p>　　Tab. 3 The Orthogonal Test Results with L9 ( 34 )</p><p>　　由k值可知最佳方案為A2B1C2D3。3.6方差分析確定最佳反應條件</p><p>　　而后對實驗結果進行方差分析。正交表中每一列方差值Sj已在表2中列出,根據Sj的大小，各因子對細菌素產量影響因素排序是牛肉膏含量影響最大，可

40、溶性淀粉含量影響最低，轉速和培養(yǎng)溫度這2個因子對細菌素產量的影響不差上下。根據F檢驗判斷各因子影響的顯著性，計算結果見表3。</p><p>　　表4　抑菌圈大小方差分析結果</p><p>　　Tab. 4　Variance Analysis of Inhibition zone size</p><p>　　由表3可知FA、FB、FC、FD都遠遠大于F( 2，1

41、8)，故A、B、C、D等因子均為高度顯著的。這主要是因為解淀粉芽孢桿菌的生長繁殖及產細菌素需要合適濃度及調配均勻的氮源，碳源。一定的溫度保證了反應體系的能量和微生物自身催化劑的活性并可提供反應的場所；而轉速的快慢表示氣-液二相接觸程度,強化傳質可以加快反應的宏觀速度。</p><p><b>　　4.結論</b></p><p>　　通過該實驗我們運用了正交設計優(yōu)化的

42、辦法優(yōu)化出了最好的細菌素發(fā)酵優(yōu)化條件，即0.5%的牛肉膏含量，1%的可溶性淀粉含量，33℃的發(fā)酵溫度以及250r/min的轉速。在這個發(fā)酵條件下，由細菌產的細菌素含量最大，抑菌圈大小達到11.1mm。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]徐顧榕等. 響應面法優(yōu)化蠟樣芽孢桿菌產類細菌素培養(yǎng)基[J]食品工業(yè)科技,2016, 19（3）:

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61、ds: structure, biosynthesis, gene structure and evolution[J]. PlantMolecular Biology, 2014, 84: 189-202.</p><p>　　[34] 孔建, 王文夕, 趙白鴿, 等. 枯草芽孢桿菌 B-903 菌株的研究: Ⅲ.影響抗菌物質產生和積累的主要因素[J].中國生物防治, 2000, 16(2):65-68.<

62、;/p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　本論文是我在老師的悉心指導和熱情關懷下完成的。老師淵博的專業(yè)知識、嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度，精益求精的工作作風，誨人不倦的高尚師德，嚴于律己、寬以待人的崇高風范，樸實無華、平易近人的人格魅力對本人影響深遠。不僅使本人樹立了遠大的學習目標、掌握了基本的研究方法，還使本人明白了許多為人處事的道理。從論文選題、試驗設計

63、、開題報告、實驗進行、后期數(shù)據采集到論文完結，導師都給予了我非常多指導性的建議。老師嚴肅的科學態(tài)度，嚴謹?shù)闹螌W精神和精益求精的工作作風，這些都是讓我受益匪淺的地方。導師的悉心指導和細心修改是此文能順利完成的重要保證。</p><p>　　時光如流水般匆匆逝去，轉眼間我在湖南農業(yè)大學也度過了四年美好的時光，轉眼便是大學畢業(yè)時節(jié)，離校日期已日趨漸進，畢業(yè)論文的完成也隨之進入了尾聲。從開始進入課題到論文的順利完成，一直

64、都離不開老師、同學、朋友給我熱情的幫助，在這里請接受我誠摯的謝意！在此我向湖南農業(yè)大學食品科學技術專業(yè)的所有老師表示衷心的感謝，在大學四年的學習時光中，我系統(tǒng)學習了食品質量與安全專業(yè)的很多知識，在學院各位老師們的諄諄教誨下，我從一個剛進大學的沒有目標，沒有理想的懵懂小青年，成為了現(xiàn)在立志在進入社會前將繼續(xù)提升自己的專業(yè)知識的食品人，真的要感謝所有老師的栽培。在今后離開農大繼續(xù)求學的漫漫長路上，我永遠不會忘記在湖南農大的四年學習時光，不會

65、忘記農大校訓中“樸誠，奮勉，求實，創(chuàng)新”給我的教誨，無論未來的路是否好走，求學的路是否布滿荊棘，我都會帶著這樣的教誨繼續(xù)走下去。除此之外，在學習生活中與我共同前行、共同進步的同學們也必須感謝。首先，感謝幫助我進行課題研究的雷文平學長、王晶晶學姐和程海生同學，你們的堅持不懈、刻苦鉆研，悉心幫助是此文能順利完成的又一保證。還要感謝我的室友與同學在大學生活中對我的照顧與幫助。感謝有你們</p><p>　　最后，我要感

66、謝我的家人給我的鼓勵與支持。當四年之前，我獨自一人踏上前往長沙的火車時，第一次獨自離開遙遠的家鄉(xiāng)來到湖南求學，雖然艱辛又困難，但是父母家人一直在后面支持鼓勵著我。走過四年大學求學路，再回首過往才發(fā)覺，家一直是我勇敢向前，突破一切困難和辛苦的最堅實的后盾。</p><p>　　試驗過程中雖然遇到了不少波折坎坷，但是我們依然不拋棄、不放棄，一直堅持到了最后。再次感謝在本科生涯中所有給予過我關心與幫助的人，感謝生命中有