莧籽ACE抑制的分離純化及其性質(zhì)評(píng)價(jià).pdf

1、籽粒莧是莧科莧屬中籽?？梢允秤玫姆N類的通稱，是一種具有優(yōu)良的耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠的抗逆優(yōu)質(zhì)植物。我國(guó)是世界上籽粒莧的主要生產(chǎn)國(guó)之一，擁有豐富的籽粒莧資源。莧籽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，蛋白質(zhì)含量17％左右，其中必需氨基酸含量占氨基酸總量37.9％，．遠(yuǎn)高于其他糧食作物;脂肪含量平均為6.2％，其中不飽和脂肪酸占總量52.7％以上，而必需脂肪酸又占不飽和脂肪酸的81.3％以上;碳水化合物含量約為60％，主要組成為淀粉。目前我國(guó)對(duì)籽粒莧的研究和產(chǎn)品開(kāi)

2、發(fā)相對(duì)落后，主要集中在蛋白質(zhì)、淀粉、色素等的提取、籽粒全粉保健食品的開(kāi)發(fā)等，而國(guó)外對(duì)籽粒莧的開(kāi)發(fā)利用比較重視，不僅深入研究莧籽蛋白質(zhì)、淀粉的性能與改性，還研究莧籽的抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖等功效，并且用籽粒莧加工的保健食品已經(jīng)商業(yè)化。用酶法水解蛋白質(zhì)制備生物活性肽是功能食品研究的熱點(diǎn)，用蛋白酶水解莧籽蛋白就能釋放出具有生物活性的多肽。高血壓是危害人類生命的最嚴(yán)重的慢性病之一，目前用于治療高血壓的藥物大部分是合成的，大多會(huì)產(chǎn)生副作用

3、。隨著人們對(duì)自身健康意識(shí)的不斷提高，這樣的藥物已不能滿足人們的需求。食物源ACE抑制肽是由食物蛋白酶解制取，安全性高，越來(lái)越受到人們的關(guān)注，尋求質(zhì)優(yōu)廉價(jià)的蛋白源是酶法制備ACE抑制肽的研究趨勢(shì)，因此利用籽粒莧開(kāi)發(fā)ACE抑制肽不僅可以為人類防治高血壓疾病提供新藥，降低降壓肽的生產(chǎn)成本，同時(shí)也可以提高籽粒莧的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，促進(jìn)籽粒莧在全國(guó)尤其是沙荒地、草荒地、鹽堿地等地區(qū)得到進(jìn)一步的推廣。
　　 本文以莧籽為原料，優(yōu)化了莧籽蛋白提取工藝

4、、蛋白酶水解莧籽蛋白制備ACE抑制肽工藝以及通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附、凝膠層析和半制備HPLC等技術(shù)分離純化出高活性的ACE抑制肽，并評(píng)價(jià)了莧籽ACE抑制肽的理化性質(zhì)，旨在為籽粒莧的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　 采用堿溶酸沉法提取莧籽中的蛋白質(zhì)，對(duì)提取過(guò)程中NaOH濃度、料液比、溫度和時(shí)間等因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響進(jìn)行系統(tǒng)的研究，明確各個(gè)因素對(duì)莧籽蛋白提取的影響，并選擇其中影響較顯著的3個(gè)因素，通過(guò)正交試驗(yàn)L9(34)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝為

5、:NaOH濃度0.018％、料液比1∶35、溫度35℃，在此條件下恒溫振蕩提取30min，莧籽蛋白質(zhì)的提取率為90.21％。
　　 探討了堿性蛋白酶Alcalase、中性蛋白酶Neutrase、復(fù)合蛋白酶Protamex、大豆多肽水解酶、風(fēng)味酶和木瓜蛋白酶對(duì)莧籽蛋白的水解效果，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶Alcalase對(duì)莧籽蛋白的酶解速率較快，酶解物的ACE抑制活性最高，因此選取堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行酶解。通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察底物

6、質(zhì)量濃度、酶與底物比、pH值和溫度對(duì)酶解物的水解度和ACE抑制率的影響，得到最佳的工藝為:底物質(zhì)量濃度4g/100mL、酶與底物比4％、pH值9.0、溫度55℃。最后通過(guò)三元二次旋轉(zhuǎn)正交組合優(yōu)化了酶解工藝參數(shù)，建立了相關(guān)回歸方程:Y=45.66371-5.353013X1-2.827188X2-10.53672X12-11.77593X22-5.268773X32+2.41875X1X2-1.67125X1X3，由模型獲得最優(yōu)的酶解條件

7、為:酶與底物比3.50％、pH值8.78、溫度54.4℃，在此條件下對(duì)底物質(zhì)量濃度4g/100mL的莧籽蛋白酶解3h，得到產(chǎn)物的ACE抑制活性IC50為0.76mg/mL。
　　 采用大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)對(duì)莧籽ACE抑制肽進(jìn)行初步分離，通過(guò)靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，對(duì)6種不同極性的樹(shù)脂進(jìn)行篩選，確定DA201-C大孔樹(shù)脂為純化莧籽ACE抑制肽的理想樹(shù)脂。通過(guò)靜態(tài)吸附試驗(yàn)分別考察酶解液質(zhì)量濃度、pH值和洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)DA201-C大

8、孔樹(shù)脂分離效果的影響，確定酶解液質(zhì)量濃度10mg/mL，pH5時(shí)，樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率最大，體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇對(duì)樹(shù)脂的解吸率最高，洗脫產(chǎn)物的脫氯率和ACE抑制率均為最大。在靜態(tài)吸附優(yōu)化基礎(chǔ)上，采用動(dòng)態(tài)吸附．解吸試驗(yàn)，考察上樣流速、上樣量、洗脫流速和洗脫體積對(duì)樹(shù)脂純化莧籽ACE抑制肽工藝的影響，確定最優(yōu)的條件為:上樣量1BV，上樣流速6mL/min，洗脫流速5mL/min，洗脫體積5BV，在此條件下，大孔樹(shù)脂的吸附率達(dá)83.69％、解吸率達(dá)

9、98.69％。經(jīng)樹(shù)脂純化后ACE抑制肽(AP)的蛋白純度為89.47％，脫鹽率為88.92％，ACE抑制活性提高了27.63％。
　　 連續(xù)采用凝膠層析、半制備RP-HPLC等技術(shù)進(jìn)一步分離純化，采用SephadexG-25凝膠層析從AP中純化出ACE抑制活性較高的AP-Ⅱ，其在質(zhì)量濃度為0.17mg/mL時(shí)ACE抑制率達(dá)43.53％。采用半制備RP-HPLC從AP-Ⅱ中純化出活性較高的AP-Ⅱ-2，其在質(zhì)量濃度為0.10mg/

10、mL時(shí)ACE抑制率達(dá)66.98％。采用RP-HPLC二次分離AP-Ⅱ-2，發(fā)現(xiàn)其可能由四種化合物組成。
　　 對(duì)SephadexG-25凝膠層析后的莧籽ACE抑制肽AP-Ⅱ進(jìn)行溶解性、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性和體外抗消化酶穩(wěn)定性等性質(zhì)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)AP-Ⅱ在pH2～12范圍內(nèi)，溶解度均大于90％，且活性幾乎沒(méi)有損失;在0～100℃的條件下具有良好的穩(wěn)定性，ACE抑制活性沒(méi)有顯著的變化;在體外具有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化酶能力，基本確定