雙低油菜籽ACE抵制肽的分離純化及其性質(zhì)評價.pdf

1、高血壓病是當(dāng)今世界最大的流行病之一,現(xiàn)代研究表明,抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性是治療高血壓的重要途徑。ACE抑制肽以其天然、無毒副作用的降壓功效,成為近年來高血壓病研究的一個熱點。
　　 菜籽餅粕是菜籽油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,我國每年菜籽餅粕產(chǎn)量居世界第一位。但是,目前我國對雙低油菜籽粕的利用相當(dāng)有限,僅用作肥料或飼料,造成了資源浪費。本課題組及其他學(xué)者已有的研究表明,通過酶解雙低油菜籽粕蛋白可以釋放出具有ACE抑制活性的

2、多肽,因此在開發(fā)降血壓健康產(chǎn)品方面具有廣闊的發(fā)展前景。
　　 本課題組已經(jīng)完成了雙低油菜籽ACE抑制肽酶法制備技術(shù)的研究。因此就研究工作的持續(xù)開展而言,進(jìn)一步需要研究的工作包括:(1)對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,得到高活性的產(chǎn)品；(2)鑒定酶解產(chǎn)物中含有的高ACE抑制活性多肽片段的結(jié)構(gòu)；(3)評價具有高ACE抑制活性多肽的性質(zhì),為后續(xù)降血壓健康產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 本研究以雙低油菜籽蛋白為原料,通過對酶解產(chǎn)物多步分

3、離純化,制備高活性雙低油菜籽ACE抑制肽,對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定,對高活性雙低油菜籽ACE抑制肽的性質(zhì)進(jìn)行了評價。具體如下:
　　 按照本課題組已經(jīng)確立的條件,用堿性蛋白酶酶解雙低油菜籽蛋白。雙低油菜籽餅粕蛋白經(jīng)超聲(料液濃度5％、溫度20℃、超聲功率600W、每批處理液15 L)預(yù)處理40 min,用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解,酶解參數(shù)為:pn9.0、溫度50℃、底物濃度5％、加酶量(E／S)5％、酶解時間30 min。在此工藝條件

4、下,酶解產(chǎn)物的IC50值為2.0 mg／mL。
　　 采用超濾技術(shù)對雙低油菜酶解產(chǎn)物中的ACE抑制肽進(jìn)行了分離提純研究,考核了分離參數(shù)對分離效果的影響。對于截留分子質(zhì)量為5 kDa的第一級超濾分離而言,操作壓力為0.5kg／cm2、多肽液溫度為45℃、多肽液濃度為3％時具有較高的分離效果；對于截留分子質(zhì)量為3 kDa的第二級超濾分離,操作壓力為0.7 kg／cm2、多肽液溫度為35℃、多肽液濃度為3％時具有較好的分離效果。在此超

5、濾工藝參數(shù)下,產(chǎn)品的IC50值下降了14％,為1.72 mg／mL,活性總回收率達(dá)到76.44％。
　　 采用葡聚糖凝膠層析和離子樹脂交換技術(shù)對雙低油菜籽ACE抑制肽進(jìn)行進(jìn)一步分離純化研究,考核了工藝參數(shù)對分離效果的影響。用SephadexG-10純化雙低油菜籽ACE抑制肽,確定最佳工藝參數(shù)為:洗脫劑為蒸餾水,洗脫劑流速為1.0 mL／min,樣品濃度為100 mg／mL,加樣量1.5 mL,在此工藝參數(shù)下,產(chǎn)品的IC50值為1

6、.22 mg／mL,下降了30％,活性肽總回收率合計為69.81％。用陽離子樹脂D061純化雙低油菜籽ACE抑制肽,確定最佳工藝參數(shù)為:初始平衡緩沖液為0.01 mol／L的醋酸緩沖液,洗脫液的組成為:A液:初始緩沖液、B液:初始平衡緩沖液+1.0 mol／L NaCl,洗脫劑流速為1.0 mL／min,上樣量100 mg,在此工藝參數(shù)下,產(chǎn)品的IC50值為0.47 mg／mL,下降了61.5％,活性肽總回收率合計為64.20％。

7、>　　 采用RP—HPIC技術(shù)對雙低油菜籽ACE抑制肽進(jìn)行進(jìn)一步分離純化研究,通過RP-HPLC多級順序分離,雙低油菜籽ACE抑制肽的IC50值進(jìn)一步下降到0.087 mg／mL。通過LC／MS分析,初步推斷高活性的雙低油菜籽ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)為Leu-Gly-Pro、Ile-Glv-Pro和Val-Ala-Pro等三肽,以及Cys-Ile和Cys-Leu等二肽。通過相關(guān)文獻(xiàn)及降血壓肽的基因庫查詢比對,發(fā)現(xiàn)已有研究從其他植物蛋白酶解產(chǎn)

8、物中分離純化出三肽Leu-Gly-Pro和Val-Ala-Pro,而三肽Ile-Gly-Pro,二肽Cys-Ile和Cys-ku等尚未見報道,還需進(jìn)一步確認(rèn)。
　　 對高活性的雙低油菜籽ACE抑制肽進(jìn)行了性質(zhì)評價。發(fā)現(xiàn)雙低油菜籽ACE抑制肽具有良好的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性,在高溫,強酸性和強堿性等條件下保留3h時,其ACE抑制活性仍保留初始值的75.54％以上。此外,雙低油菜籽ACE抑制肽具有較好的抗胃腸道酶解性,經(jīng)胃腸道模擬消化