S-卵白蛋白與雞蛋鮮度相關(guān)性及其純化、性質(zhì)研究.pdf

1、卵白蛋白是雞蛋中最豐富的蛋白質(zhì)組分，占蛋清蛋白總量的54%，為43.0 kDa的單體、球狀磷酸糖蛋白，自然卵白蛋白(N-卵白蛋白)在雞蛋貯存或孵化期間不可逆地轉(zhuǎn)化為熱穩(wěn)定形式(S-卵白蛋白)。S-卵白蛋白為N-日白蛋白的構(gòu)象異構(gòu)體，S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化進(jìn)程中分子特性與理化性質(zhì)發(fā)生相應(yīng)變化。本課題研究S-卵白蛋白與雞蛋鮮度的相關(guān)性，考察貯藏條件對S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化的影響；采用兩步超濾技術(shù)、聚乙二醇沉淀和陰離子交換層析法分離純化卵白蛋白；研究S-構(gòu)型

2、轉(zhuǎn)化對卵白蛋白分子及乳化特性、微觀結(jié)構(gòu)的影響；考察白藜蘆醇、核黃素、姜黃素等活性小分子與S-卵白蛋白的相互作用，研究超高壓處理對S-卵白蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響。
　　 探討以S-卵白蛋白為指標(biāo)、通過等價蛋齡評價商業(yè)雞蛋鮮度的可行性。分別測定25℃和37℃條件下85枚鮮蛋的S-卵白蛋白含量、蛋黃指數(shù)、蛋清pH值和哈夫單位等指標(biāo)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，S-卵白蛋白與貯存時間及雞蛋鮮度評價常用指標(biāo)之間具有高度相關(guān)性。指數(shù)回歸模

3、型分析建立了等價蛋齡預(yù)測模型，將S-卵白蛋白含量轉(zhuǎn)換為等價蛋齡(25℃)，可評價不同條件下貯存雞蛋的鮮度。研究證實以S-卵白蛋白為指標(biāo)評價商業(yè)雞蛋鮮度是可行的。
　　 為了探討貯存條件對雞蛋清S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化的影響，考察了貯存溫度、濕度、二氧化碳濃度及涂膜處理等4個影響因素。結(jié)果表明，S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化與貯存溫度呈正相關(guān)，高溫能加速轉(zhuǎn)化；S-卵白蛋白含量受濕度影響不顯著，高濕僅能有限抑制S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化；低濃度CO2(2.5%)抑

4、制S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化效果不明顯，而高濃度Co2(≥5.0%)抑制效果顯著；涂膜處理能顯著抑制S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化，尤其是油溶性涂膜劑、礦物油涂膜處理抑制效果極顯著。
　　 基于超濾機(jī)理分析了超濾過程中初始料液體積分?jǐn)?shù)、pH值和跨膜壓力等參數(shù)對膜通量、透過液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響。在考察膜通量變化確定超濾時間的基礎(chǔ)上，通過超濾試驗獲得最佳工藝條件：初始料液體積分?jǐn)?shù)6.0%，pH值2.5，跨膜壓力0.12 Mpa。超濾產(chǎn)物純度、回收率較高，

5、卵白蛋白、溶菌酶的純度分別為85.72%、87.21%，回收率分別為51.36%、62.58%。試驗結(jié)果表明，兩步超濾法可用于雞蛋清卵白蛋白與溶菌酶的規(guī)模化、高效分離。
　　 采用聚乙二醇(PEG)使其它蛋清蛋白質(zhì)沉淀，然后用陰離子交換層析進(jìn)一步純化上清液，獲得高純度卵白蛋白產(chǎn)物。結(jié)果表明，15%PEG-8000沉淀可有效地將卵白蛋白與其它蛋清蛋白分離，上清液經(jīng)Q-Sepharose F F陰離子交換層析純化，卵白蛋白產(chǎn)物純度高

6、達(dá)94.84%，回收率達(dá)71.45%。該法操作簡單、周期短，純度和回收率均理想，可用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
　　 采用DEAE Sepharose C1-6B離子交換純化N-卵白蛋白、堿性條件下熱誘導(dǎo)制備S-卵白蛋白，對S-卵白蛋白分子及乳化特性進(jìn)行研究，探討二者之間內(nèi)在聯(lián)系。研究S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)程中游離氨基含量、Zeta電位、疏水性、乳化液滴平均粒徑(d32)與乳化活性的變化情況。在此基礎(chǔ)上對以上因子進(jìn)行相關(guān)性分析，并對S-卵

7、白蛋白的乳化液進(jìn)行顯微鏡觀察。RP-HPLC顯示N-卵白蛋白純度達(dá)98%，差示掃描量熱(DSC)分析顯示誘導(dǎo)制備了S-卵白蛋白，在S-卵白蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)程中存在過渡產(chǎn)物(I-卵白蛋白)。S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化使游離氨基含量增加54.69%、Zeta電位降低7.1 mV、乳化液滴平均粒徑(d32)減少2.07μm，疏水性提高76.88%，乳化活性提高38.92%，而乳化穩(wěn)定性減少51.07%。顯微鏡觀察結(jié)果表明，S-卵白蛋白易于形成較小的乳化液滴。S-

8、卵白蛋白的轉(zhuǎn)化能有限改善卵白蛋白的乳化活性，卻降低乳化穩(wěn)定性，卵白蛋白的S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化是蛋清蛋白品質(zhì)劣化的原因之一。
　　 采用圓二色譜、X射線衍射、ANS熒光探針和紫外光譜研究了S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化對卵白蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，不同誘導(dǎo)時間處理的卵白蛋白二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲之間相互轉(zhuǎn)化，α-螺旋略有減少，β-折疊相應(yīng)增加，分子有序性提高。S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化后卵白蛋白晶體結(jié)構(gòu)增加，72 h處理后結(jié)晶區(qū)最大，說明

9、蛋白結(jié)構(gòu)的有序性提高，與CD分析結(jié)果一致。卵白蛋白的表面疏水性隨誘導(dǎo)時間的延長而增強(qiáng)，72 h處理后達(dá)到最大值。S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化使卵白蛋白分子表面具有紫外吸收的芳香氨基酸殘基包埋于分子內(nèi)部，導(dǎo)致最大紫外吸光值隨誘導(dǎo)時間的延長而下降。研究表明，卵白蛋白的微觀結(jié)構(gòu)變化與S.構(gòu)型轉(zhuǎn)化有關(guān)。
　　 采用熒光猝滅光譜、同步熒光光譜和紫外光譜研究白藜蘆醇、核黃素、姜黃素等3種活性小分子與S-卵白蛋白的相互作用機(jī)制。根據(jù)Stern-Volmer方

10、程研究了結(jié)合作用機(jī)理，由熱力學(xué)參數(shù)的計算判斷了主要作用力類型，并依據(jù)能量轉(zhuǎn)移原理求得了結(jié)合距離和能量轉(zhuǎn)移效率。研究表明，3種小分子對S-卵白蛋白內(nèi)源性熒光產(chǎn)生強(qiáng)烈的猝滅作用，猝滅機(jī)理主要為靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移；3種小分子與S-卵白蛋白間結(jié)合位點數(shù)n≈1、結(jié)合距離均小于7 nm；作用力均以氫鍵和范德華力為主，且為吉布斯自由能降低的自發(fā)過程；同步熒光、紫外光譜研究表明3種小分子能夠使S-卵白蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化。
　　 采用激光拉

11、曼光譜、熒光光譜分析超高壓(UHP)處理對S-卵白蛋白構(gòu)象的影響，并考察其對溶解性、乳化性和起泡性等功能特性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)UHP處理后S-卵白蛋白的分子量分布沒有明顯變化。隨著壓力的增加，無規(guī)卷曲含量逐漸增加，二硫鍵構(gòu)象變化使得蛋白穩(wěn)定性降低，酪氨酸殘基包埋于側(cè)鏈中，緊密折疊結(jié)構(gòu)得以舒展。經(jīng)100 Mpa處理后S-卵白蛋白的熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，此后急劇下降，無峰位位移現(xiàn)象，說明UHP引起蛋白分子構(gòu)象變化。S-卵白蛋白的溶解性、乳化能