橙汁中酵母菌的分離鑒定及其快速分子檢測技術(shù)研究.pdf

1、橙汁是最重要的柑橘加工品，其國際貿(mào)易額已占柑橘貿(mào)易總額的1/3以上。我國的柑橘種植面積和產(chǎn)量均居世界第一，但橙汁產(chǎn)量只占世界總產(chǎn)量的1％左右。為滿足快速增加的橙汁消費量，減少對進口的依賴，我國正逐漸從優(yōu)化柑橘產(chǎn)業(yè)布局、增加汁用甜橙栽培面積和降低原料成本等方面促進橙汁產(chǎn)業(yè)發(fā)展。伴隨著這種發(fā)展，我國急需建立和完善橙汁的質(zhì)量和安全保障體系。由酵母菌污染引起的橙汁腐敗是產(chǎn)業(yè)長期面臨的主要問題之一，更是不添加防腐劑的NFC橙汁生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵

2、問題之一。與致病菌的檢測相比，國內(nèi)針對食品中酵母菌檢測的研究較少。目前，我國食品和飲料中的酵母菌檢測仍采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，所需時間長、檢測結(jié)果滯后，不能及時指導(dǎo)生產(chǎn)。因此，為有效控制酵母菌污染，建立一套快速、有效的酵母菌檢測方法對我國橙汁的安全生產(chǎn)和消費都具有重要意義。
　　 本論文采用平板法分離橙汁中的酵母菌，通過形態(tài)觀察、5.8SrDNA及其ITS間隔區(qū)序列RFLP分析和26SrDNAD1/D2區(qū)序列測定相結(jié)合的方法鑒定分

3、離菌株。并且在改進DNA提取方法、優(yōu)化PCR擴增體系的基礎(chǔ)上建立了酵母菌PCR快速檢測體系。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以63份腐敗橙汁為材料，利用平板法進行微生物分離計數(shù)，測得腐敗橙汁中酵母菌的濃度在104CFU/mL～107CFU/mL。進一步分析表明，104CFU/mL，酵母菌使橙汁呈現(xiàn)出脹瓶和變清等腐敗特征，106CFU/mL～107CFIU/mL，酵母菌能使橙汁產(chǎn)品出現(xiàn)明顯的脹瓶現(xiàn)象。
　　 2.對橙汁中主要

4、的酵母菌進行了形態(tài)觀察。Pichiafermentans在YPD培養(yǎng)基上生長，菌落表面呈現(xiàn)輻射分布的精致的條紋，可用于快速識別該種酵母。對菌株Y17-2和Y19菌落形態(tài)進行連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)酵母菌落形態(tài)是動態(tài)變化的，可通過特定時期出現(xiàn)的明顯特征識別酵母菌。Pichia屬的7株酵母菌可根據(jù)菌落形態(tài)差異分為6組，與核糖體DNA序列聚類分析的結(jié)果一致。也對Clavisporalusitaniae、Candidasake、Hanseniaspora

5、uvarum和Candidaparapsilosis等主要酵母污染菌在WL培養(yǎng)基上的菌落特征進行觀察，這些菌落在顏色和形態(tài)上都有差異。研究結(jié)果表明：酵母在菌落特征上的差異與其核糖體DNA序列差異的結(jié)果一致。因此，采用菌落特征觀察來鑒別橙汁中主要的腐敗酵母菌是行之有效的快速鑒定方法之一。
　　 3.以107CFU/mL和104CFU/mL的Saccharomycescerevisiae菌液為材料，對細(xì)胞破碎方式進行比較后選擇最佳破

6、壁方法，并對研磨破壁時提取液的用量進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的DNA提取方法如下：
　　 1.5mL樣品在13000rpm離心3min收集菌體；80μL提取液、90mg石英砂研磨3min，加320μL提取液；水浴10min，加250μL6mol/LNaCl溶液和等體積的氯仿：異戊醇(24：1)去除雜質(zhì)，然后無水乙醇沉淀DNA，最后用50μLddH2O溶解。
　　 4.以提取自104CFU/mL菌液的DNA為模板優(yōu)化PCR擴增體系

7、。對PCR各組分進行優(yōu)化的結(jié)果是：dNTP0.2mmol/L、引物濃度各0.4μmol/L，rTaq酶1.5U/25μL-Mg2+1.5mmol/L，或者rTaq酶1U/25μL-Mg2+2.5mmol/L有利于檢測低濃度酵母菌。
　　 5.以8株代表酵母菌為材料比較5.8S-ITS區(qū)RFLP分析、5.8S-ITS區(qū)測序分析和26SrDNAD1/D2區(qū)測序分析對酵母菌的鑒定效果。3種鑒定法方法的鑒定結(jié)果一致，表明5.8S-ITS

8、區(qū)RFLP分析與D1/D2區(qū)序列測定結(jié)合可快速準(zhǔn)確地鑒定酵母菌。從橙汁分離菌中鑒定出分屬于17屬的26種酵母，主要的酵母菌及其出現(xiàn)的頻率如下：Clavisporalusitaniae(13％)、Candidasake(11％)、Saccharomycescerevisiae(11％)、Hanseniasporauvarum(7％)、Candidaparapsilosis(6％)和Meyerozymaguilliermondii(6％)。

9、分離菌中有10種酵母菌在橙汁中少見報道，表明橙汁中酵母菌的種類多，值得進一步分析。
　　 6.以106CFU/mL～101CFU/mL菌液和接種橙汁為材料，用常規(guī)PCR、熱啟動PCR和熒光定量PCR進行檢測。常規(guī)PCR可檢測接種橙汁中104CFU/mL酵母菌，表明檢測靈敏度比原有的常規(guī)PCR檢測106CFU/mL酵母菌提高了100倍，比原有的DNA經(jīng)純化后檢測105CFU/mL酵母菌的靈敏度提高了10倍；使用熱啟動PCR可檢測1

10、03CFU/mL酵母菌，是提高檢測靈敏度的方法之一。以真菌通用引物NL1/NL4為引物，熒光定量PCR可檢測40fg酵母菌DNA，能檢測菌液中101CFU/mL酵母，但只能檢測接種橙汁中104CFU/mL的酵母菌，這表明熒光定量PCR檢測靈敏度高于常規(guī)PCR，但仍受橙汁中的某些物質(zhì)的抑制而無法檢測低濃度的酵母菌。
　　 7.以7種已鑒定的橙汁分離酵母菌為材料，進行5.8S-ITS區(qū)熔解曲線分析，以考察能否用通過5.8S-ITS區(qū)

11、熔解溫度鑒別橙汁中的酵母菌。7種酵母菌5.8S-ITS區(qū)的熔解溫度如下：Candidaparapsilosis(80.10±0.0℃)、Rhodotorulaglutinis(80.95±0.05℃)、Debarryomyceshansenii(81.70±0.0℃)、MeyerozymaguilliermondiiY56(82.60±0.0℃)、Candidaintermedia(83.80±0.0℃)、Hanseniasporasp