啤酒中污染菌的分離純化、快速檢測(cè)與鑒定.pdf

1、啤酒中污染菌是啤酒生產(chǎn)中不可避免的一種生物污染。準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)和鑒定出啤酒中的污染菌不僅能保證啤酒品質(zhì)，還體現(xiàn)出啤酒企業(yè)所具有的高技術(shù)水平。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，污染菌的檢測(cè)方法也日新月異，現(xiàn)在已經(jīng)成熟應(yīng)用的有選擇性培養(yǎng)基和5種檢測(cè)和鑒定方法，它們分別是ATP法、抗原抗體免疫法、PCR擴(kuò)增法、原位雜交法和D-乳酸脫氫酶的電泳譜圖法。 本研究的主要內(nèi)容是使用選擇性培養(yǎng)基分離純化出10種污染菌，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)把它們分別編號(hào)為L(zhǎng)s、

2、Lm、Ll、Lsuper、Lw、P、4-1、5221、5222、928，利用API50CHL鑒定試劑條把它們分別定義為植物乳桿菌、乳酸菌乳球菌乳亞種、短乳桿菌3、短乳桿菌3、短乳桿菌1、短乳桿菌1、植物乳桿菌2、布氏乳桿菌、食果糖乳桿菌、德氏乳桿菌德亞種、不可判定菌種。 為了更準(zhǔn)確地鑒定上述細(xì)菌，本研究使用了參考引物“27F-907R”作為測(cè)序引物，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該引物所產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增結(jié)果條帶單一、清晰明亮。經(jīng)過(guò)測(cè)序和網(wǎng)上BLA

3、ST軟件比對(duì)確定Ls屬于Lactobacillusplantarum，4-1和5221屬于Lactobacillus parabuchneri，Lm、Lw、P和5222屬于Lactobacillus perolens，928屬于C.berincldi，Ll的比對(duì)結(jié)果則是屬于“Unculmred bacterium clone rRNA228 16S ribosomal RNAgene”即不能確定具體的種。但是根據(jù)API50CHL的鑒定結(jié)

4、果和參考的與自己設(shè)計(jì)的短乳桿菌特異性引物經(jīng)過(guò)PCR鑒定為短乳桿菌，故確定Ll為L(zhǎng)actobacillus brevis。根據(jù)測(cè)序的結(jié)果設(shè)計(jì)出三套種鑒定引物，他們分別是Lactobacillusbrevis、Lactobacillu parabuchneri和Lactobacillus perolens鑒定引物，然后通過(guò)條件優(yōu)化確定最佳的退火溫度和退火時(shí)間，它們分別為45℃1min、55℃2min和56℃2min。外加參考的Lactoba

5、cillus brevis和Lactobacillus plantarum種特異性引物組成一個(gè)種鑒定引物系列。 對(duì)經(jīng)過(guò)鑒定的污染菌進(jìn)行抗啤酒花性和啤酒污染性鑒定，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定Ls、Lm、Ll、LW、P、4-1、5221、5222、928最大的抗啤酒花濃度依次為L(zhǎng)l>928>Lw>5221>Lm、4-1>Ls、P>5222，同時(shí)啤酒污染能力的大小順序依次為L(zhǎng)1、Lw>5221>P>Ls、Lm>5222>4-1。用啤酒花對(duì)污染菌進(jìn)行

6、馴化，最大的馴化濃度大小依次為L(zhǎng)l、LW>P>Lm>5221、928>4-1、Ls>5222，顯然經(jīng)過(guò)馴化后抗啤酒花能力出現(xiàn)了比較大的變化，特別是Lw、P的抗啤酒花性有很大的提高。通過(guò)對(duì)抗啤酒花基因horA、horB和horC擴(kuò)增確定了抗啤酒花基因的拷貝數(shù)多少依次為L(zhǎng)l、LW、P、5221>4-1、Ls>5222、Lm，這與最大馴化濃度大小順序和啤酒污染濃度大小順序相吻合。最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定啤酒花的馴化濃度和horA的拷貝數(shù)呈正相關(guān)。最后