長(zhǎng)枝木霉SMF2peptaibols合成酶和蛋白酶基因敲除體系的構(gòu)建及其peptaibols在植物生長(zhǎng)中的功能研究.pdf

1、木霉（Trichodermaspp.）是一種腐生型絲狀真菌，廣泛分布在土壤、植物根際和葉面。木霉是一種重要的生防因子，對(duì)多種植物病原真菌具有很強(qiáng)的抑制作用。其生防作用機(jī)制包括抗生作用、重寄生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用和誘導(dǎo)植物抗性等。Peptaibols等次級(jí)代謝產(chǎn)物和胞外酶類在木霉的抗生作用的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。長(zhǎng)枝木霉SMF2(T.longibrachiatumSMF2，SMF2)菌株是本實(shí)驗(yàn)室篩選到的具有較強(qiáng)生防活力的菌株，前期研究發(fā)現(xiàn)其

2、能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶(cellwalldegradeenzymes，CWDEs)和peptaibols類抗菌物質(zhì)-Trichokonins。Trichokonins的主要組分TrichokoninⅥ(TKⅥ)含有20個(gè)氨基酸殘基。本實(shí)驗(yàn)室已建立了Trichokonins的固體發(fā)酵技術(shù)和簡(jiǎn)單高效的分離純化技術(shù)。在此基礎(chǔ)上對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了系列研究，Trichikonins具有抗菌、抗病毒、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)植物抗性等多種生物學(xué)活

3、性。前期實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，低濃度的TrichokoninⅥ能夠促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育而高濃度處理則抑制根系生長(zhǎng)，但其與植物的相互作用機(jī)制尚未研究，目前也缺乏peptaibols與植物相互作用機(jī)制的研究。
　　本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)SMF2的基因組的分析結(jié)果，找到該菌株基因組中含有2個(gè)長(zhǎng)的非核糖體合成酶(Non-ribosomalpeptidesynthetase，NRPS)編碼基因負(fù)責(zé)peptaibols的合成，分別命名為tpx

4、1和tpx2，其分別含有20個(gè)module和12個(gè)module。本研究根據(jù)同源重組原理，選用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph和乙酰胺酶基因amdS作為篩選標(biāo)記，構(gòu)建了peptaibols合成酶基因的敲除載體，通過(guò)PEG-CaCl2轉(zhuǎn)化法，對(duì)tpx1，tpx2進(jìn)行基因敲除，通過(guò)PCR篩選和Southern雜交驗(yàn)證，獲得了SMF2tpx1和tpx2基因缺失的SMF2突變株。
　　Peptaibols合成酶缺失突變株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析證實(shí)

5、含有20個(gè)module的peptaibols合成酶基因tpx1控制一系列含有20個(gè)氨基酸的peptaibols的合成，而含有12個(gè)module的peptaibols合成酶基因tpx2控制含有12個(gè)氨基酸殘基的peptaibols的生物合成。表型分析發(fā)現(xiàn)，peptaibols合成酶的缺失對(duì)木霉菌落形態(tài)、菌絲的生長(zhǎng)和孢子的形成等生物學(xué)特征沒(méi)有顯著的影響。
　　體外研究表明，木霉Trichokonins能夠影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，但是目前還

6、缺乏SMF2與植物互相作用實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。本研究采用番茄作為實(shí)驗(yàn)植物，進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，研究了SMF2野生型菌株及其peptaibols合成酶缺失突變株對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:野生型SMF2能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，提高番茄生物量，促進(jìn)根系的發(fā)育，而peptaibols合成酶的缺失，尤其是tpx2的缺失，影響木霉菌株對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。因此peptaibols的產(chǎn)生是木霉促進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)制之一。研究還發(fā)現(xiàn)，野生型和突變株與對(duì)照相比，都具有

7、一定的促生作用，這表明SMF2中的其他生物活性物質(zhì)也可能在其促生作用中發(fā)揮著作用。
　　前期研究還發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶SprT具有很好的抗菌、殺線蟲活性，本研究根據(jù)同源重組原理，選用hph作為篩選標(biāo)記，運(yùn)用融合PCR技術(shù)構(gòu)建了sprT基因敲除載體，通過(guò)基因敲除方法獲得SMF2sprT缺失突變子。絲氨酸蛋白酶sprT缺失突變株表型分析表明sprT的缺失不影響SMF2菌絲的生長(zhǎng)、菌落形態(tài)和孢子的形成。突變株固體發(fā)酵粗提液的蛋白酶酶活下降，