雞蛋清中核黃素結(jié)合蛋白分離純化及其與核黃素、銅離子相互作用的研究.pdf

1、核黃素結(jié)合蛋白(riboflavin binding protein，RBP)是禽蛋中天然存在的一種糖磷蛋白，分別具有一個核黃素和二價銅離子結(jié)合位點(diǎn)，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。但目前關(guān)于RBP與核黃素及銅離子的結(jié)合機(jī)制仍不完善。本文采用硫酸銨鹽析結(jié)合離子交換法的工藝對蛋清中RBP進(jìn)行分離純化后，分別運(yùn)用熒光光譜、紫外可見光譜、傅立葉變換紅外光譜和電化學(xué)法研究其與核黃素及銅離子的相互作用。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.采用硫

2、酸銨鹽析和離子交換層析相結(jié)合的工藝分離純化RBP。研究了硫酸銨飽和度對核黃素結(jié)合蛋白粗提的影響，采用55%-85%兩步(NH4)2SO4鹽析，可以去除部分卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和幾乎所有的卵黏蛋白。同時對DEAE-Toyopearl650M離子交換層析純化工藝條件進(jìn)行研究，得出Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液pH值6.5，濃度0.1 mol/L，NaCl洗脫濃度為0.25 mol/L，最佳上樣量200 mL(樣品濃度20 mg/mL)

3、。純化后樣品經(jīng)HPLC鑒定純度高達(dá)95.32%，總回收率為57.36%。熒光猝滅實(shí)驗(yàn)說明純化獲得的RBP保留了結(jié)合核黃素的活性。
　　 2.為了闡明Apo-RBP與核黃素的結(jié)合機(jī)制，運(yùn)用紫外可見光譜、熒光光譜和紅外光譜研究了Apo-RBP與核黃素的相互作用。熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核黃素對Apo-RBP的猝滅機(jī)理是通過兩者的結(jié)合而發(fā)生的靜態(tài)猝滅。其中，二者的結(jié)合常數(shù)為5.35×108 L·mol-1。結(jié)合過程中熱力學(xué)參數(shù)△H為-88.8

4、7 kJ/mol，△S為-131.34 J/(K·mol)，兩者均小于零，說明核黃素與Apo-RBP間主要靠氫鍵和范德華力結(jié)合。同時，F(xiàn)(o)rster能量轉(zhuǎn)移理論確定了核黃素與Apo-RBP的作用距離和能量轉(zhuǎn)移效率分別為0.70 nm和0.39。結(jié)合核黃素后Apo-RBP紫外可見光譜及同步熒光光譜，表明核黃素的加入使Apo-RBP芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境疏水性增強(qiáng)。比較了結(jié)合核黃素前后的Apo-RBP FT-IR光譜發(fā)現(xiàn)蛋白的二級結(jié)構(gòu)

5、沒有顯著變化(P>0.05)。最后研究了不同金屬離子對核黃素與Apo-RBP結(jié)合常數(shù)的影響，結(jié)果表明Zn2+、Cu2+、K+、Ca2+加入后核黃素與Apo-RBP的結(jié)合常數(shù)分別變化為3.26×109 L·mol-1、3.69×108 L·mol-1、0.72×107 L·mol-1、9.83×105 L·mol-1，說明Zn2+對兩者之間的結(jié)合有增強(qiáng)作用，Ca2+、K+兩種離子將降低兩者間的結(jié)合，Cu2+對兩者間的結(jié)合常數(shù)影響不大。

6、r>　　 3.采用光譜法研究Cu(Ⅱ)與Apo-RBP之間的相互作用，結(jié)果表明Cu(Ⅱ)對Apo-RBP的熒光猝滅機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅?？疾炝藴囟?、pH、核黃素、NaCl濃度對Cu(Ⅱ)與蛋白質(zhì)結(jié)合的影響，發(fā)現(xiàn)pH對Cu(Ⅱ)與Apo-RBP結(jié)合影響作用較大，隨著pH的升高Cu(Ⅱ)與Apo-RBP的結(jié)合常數(shù)先升高達(dá)到平衡后又降低，最適pH為7.0-8.0；溫度和NaCl濃度對兩者間的結(jié)合常數(shù)影響不顯著；由核黃素對兩者結(jié)合影響的結(jié)果推測C

7、u(Ⅱ)和核黃素與蛋白質(zhì)非同一結(jié)合位點(diǎn)。另外通過ANS實(shí)驗(yàn)表明Cu(Ⅱ)與Apo-RBP結(jié)合位點(diǎn)可能位于蛋白質(zhì)疏水區(qū)域內(nèi)。利用紫外可見吸收光譜、同步熒光光譜、傅里葉紅外光譜研究了Apo-RBP與Cu(Ⅱ)結(jié)合后Apo-RBP的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)酪氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，結(jié)合Cu(Ⅱ)后RBP的α-螺旋由26.45%下降至17.48%、β-折疊由18.15%下降至14.01%、β-轉(zhuǎn)角由18.40%下降至14.01%，同時無規(guī)卷曲由13

8、.05%增大至23.91%，說明結(jié)合Cu(Ⅱ)使Apo-RBP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，結(jié)構(gòu)由有序向無序轉(zhuǎn)變。
　　 4.為了進(jìn)一步探討Cu(Ⅱ)與Apo-RBP的結(jié)合機(jī)制，采用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法研究了Cu(Ⅱ)與Apo-RBP結(jié)合前后的電化學(xué)行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH7.0 Tris-HCl緩沖液中Cu(Ⅱ)有兩個氧化峰和兩個還原峰，而核黃素結(jié)合蛋白在掃描范圍0.2 V～-1.0 V內(nèi)沒有氧化還原峰，說明核黃素結(jié)合蛋白在該電壓范圍內(nèi)沒有

9、電化學(xué)活性。加入Apo-RBP后，銅離子的循環(huán)伏安圖中兩個氧化峰電流分別從11.23μA和6.19μA下降至5.63μA和3.24μA；兩個還原峰電流分別從5.03μA和14.28μA下降至3.03μA和11.02μA，同時差分脈沖伏安法測定的Cu(Ⅱ)的兩個氧化峰電流分別從16.14μA和15.69μA下降至15.69μA和5.55μA，表明Cu(Ⅱ)與Apo-RBP相互作用形成非電化學(xué)活性的化合物，由此說明Apo-RBP具有穩(wěn)定Cu