核黃素受體蛋白影響植物生長和抗病性信號傳導的初步研究.pdf

1、核黃素在生物體內(nèi)形成黃素單核苷酸FMN及黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，它們是黃素酶的輔酶。核黃素所形成的輔酶參與機體組織維生素C抗氧化作用的呼吸電子傳遞及氧化還原過程，參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應過程中活性氧中間體(ROIs)的產(chǎn)生，而ROIs是過敏細胞壞死的重要信號，能調節(jié)生長、抗病、抗蟲、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應有關。外施核黃素可誘導植物抗病性，體內(nèi)核黃素水平可能對抗病防衛(wèi)和生長發(fā)育過程有影響。因此

2、，如果能夠控制核黃素水平，就能相應控制這些重要過程，提高植物抗病防衛(wèi)的能力并促進植物生長發(fā)育。這是研究核黃素參與的植物防衛(wèi)和生長調控交叉的重要點切入點。 核黃素運載蛋白質(RCP)或受體蛋白質(RfBP)，首先在雞蛋和卵生鳥類的血清中發(fā)現(xiàn)。它是一種單體、酸性的磷糖蛋白，對自由態(tài)的核黃素有高度的親和性．最近報道，RCP是排卵卵母細胞和早期胚胎細胞膜一種組份，同時也是嚙齒動物和其他的哺乳動物的成熟精液神經(jīng)元體細胞末梢區(qū)域的一種組份。

3、核黃素通過母雞生蛋傳送到雞蛋的過程，就是被雞核黃素運載蛋白或結合蛋白 BfBP，一種27,000 Da 的蛋白所調控的。 在本研究中，作者克隆了軟體海龜?shù)暮它S素受體基因(RfBP)，將其克隆至pGEM-T Easy載體經(jīng)測序驗證無誤后分別克隆至pETF30a(+)載體，構建了表達融合蛋白His-tagged RmP的原核表達載體。研究表明，融合蛋白表達菌株BL21(DE3)pLySs：：pRfBP在1 mM IPTG、37℃誘

4、導4 h的條件下都能夠很好地表達融合蛋白His-tagged RfBP，且主要以可溶形式存在。繼續(xù)提高誘導劑IPTG的濃度和延長誘導時間對其表達量影響不大。 利用HisTrap HP Kit試劑盒對RfBP進行了純化。每升誘導培養(yǎng)細胞可收獲RfBP蛋白2 mg，濃度達到了0.5～1.5 mg/ml。His-tagged RfBP融合蛋白不能夠在煙草上引起過敏反應。分別用提純的軟體海龜RfBP和雞的RfBP蛋白免疫新西蘭大白兔制

5、備了抗血清，抗軟體海龜RfBP血清的效價可達1：64,000以上，而抗雞RfBP血清的效價可達1：256,000以上。在酶聯(lián)免疫、Western blot分析中，兩種RfBPs的多克隆抗體均能夠檢測含有RfBP蛋白的不同樣品。兩抗體之間存在一定程度的交叉反應。由于軟體海龜和雞的RIBP基因的推測產(chǎn)物氨基酸序列一致性達71.3％，這是它們之間存在交叉反應的重要原因。為進一步探討核黃素在植物抗病及生長過程中的作用，本研究使用核黃素受體蛋白(