植物防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程中核黃素信號(hào)調(diào)節(jié)的遺傳與轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、本博士學(xué)位論文著重解析體外噴施核黃素誘導(dǎo)的抗病機(jī)制、轉(zhuǎn)核黃素受體基因植物的抗病機(jī)制以及內(nèi)源核黃素含量調(diào)控所影響的生理過(guò)程和代謝途徑,為闡明核黃素參與調(diào)控植物生長(zhǎng)和防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制及與其他激素或非激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交叉對(duì)話提供研究基礎(chǔ)。 1 外源核黃素誘導(dǎo)的引發(fā)抗病防衛(wèi)反應(yīng)依賴過(guò)氧化氫和NPR1基因 致壞死型病原菌接種后,植物具備了增強(qiáng)的防衛(wèi)反應(yīng)激活能力以應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫,這一過(guò)程稱為引發(fā)(priming)。引發(fā)狀態(tài)(p

2、rimed state)也可以被有益微生物根部定殖和許多天然或合成物質(zhì)處理植物后誘導(dǎo)產(chǎn)生。近幾年的研究表明,引發(fā)可能是植物誘導(dǎo)抗性的重要機(jī)制。核黃素處理擬南芥誘導(dǎo)PR-1和PR-2基因的表達(dá),而PAL1誘導(dǎo)表達(dá)不顯著。核黃素預(yù)先處理,再接種丁香假單胞番茄致病變種DC3000后,激發(fā)植物體內(nèi)更強(qiáng)的細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)并誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)基因更強(qiáng)更快的表達(dá),同時(shí)誘發(fā)過(guò)氧化氫的積累、胼胝質(zhì)沉積和過(guò)敏性細(xì)胞死亡。用過(guò)氧化氫清除劑完全消弱了植物細(xì)胞和分子水平的

3、防衛(wèi)反應(yīng)及其對(duì)病原菌的抗性。核黃素處理并接種病原菌誘發(fā)的細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)在水楊酸、乙烯、茉莉酸和脫落酸信號(hào)通路的突變體上可以產(chǎn)生,但在npr1突變體中消失。研究結(jié)果表明,外施核黃素使植物進(jìn)入引發(fā)狀態(tài),接種病原菌時(shí),植物體內(nèi)積累高濃度的過(guò)氧化氫,并激發(fā)細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)和相關(guān)基因的快速且高強(qiáng)度表達(dá)以及對(duì)病原菌的抗性,這一過(guò)程依賴于過(guò)氧化氫和NPR1基因,但不依賴于水楊酸、乙烯、茉莉酸和脫落酸信號(hào)通路。 2 轉(zhuǎn)中華鱉核黃素受體基因植物表達(dá)譜分

4、析 本實(shí)驗(yàn)室把中華鱉的核黃素受體基因轉(zhuǎn)入擬南芥,借以調(diào)節(jié)核黃素含量及對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)和有關(guān)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的影響。轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)核黃素含量高于野生型水平,沉默核黃素受體基因后,沉默植物內(nèi)的核黃素恢復(fù)到野生型水平。我們利用擬南芥基因組芯片(ATH1 Affymetrix chip)分析轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)譜的變化。預(yù)雜交實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量控制檢驗(yàn)顯示,表達(dá)譜芯片及樣品cRNA產(chǎn)物質(zhì)量較好,表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)成功,數(shù)據(jù)可靠。應(yīng)用GCOS(GeneChipR O

5、perating Software)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析獲得的原始數(shù)據(jù),再用RMA(robust multiarray analysis)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理后,根據(jù)隨機(jī)方差模型的單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照進(jìn)行比較,以篩選兩兩分組之間的差異基因。對(duì)于差異基因的篩選方法基于FDR(false discovery rate)<0.1,p<0.05,Permutation P<0.05。根據(jù)基因在兩個(gè)分組中的幾何平均數(shù)的比值倍數(shù)決定差異基因的變化方向

6、,我們選取比值>2的基因?yàn)轱@著上調(diào)基因,比值<0.5的為顯著下調(diào)基因。結(jié)果表明,共有320個(gè)基因顯著上調(diào),630個(gè)基因顯著下調(diào)。我們隨機(jī)選取部分基因?qū)π酒Y(jié)果進(jìn)行RT-PCR和Real-time PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示表達(dá)結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)相吻合。隨后,對(duì)表達(dá)差異顯著的基因在擬南芥信息中心進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)分析,按照GO數(shù)據(jù)庫(kù)的主子集生物學(xué)過(guò)程以獲取它們確切的GO分類信息。接著,我們又利用代謝途徑分析程序MapM

7、an,分析差異表達(dá)基因所屬的代謝途徑,以期了解轉(zhuǎn)基因植物中代謝過(guò)程的變化。我們著重列舉了次級(jí)代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄因子、線粒體電子傳遞、氧化還原調(diào)控等代謝過(guò)程的變化。同時(shí)我們選取了植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因、激素信號(hào)途徑相關(guān)基因和蛋白激酶基因這三類基因及其他個(gè)別基因進(jìn)行了簡(jiǎn)要的分析。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植物中差異表達(dá)的基因涉及很多生理過(guò)程、代謝途徑、激素及非激素信號(hào)途徑。尤其令人感興趣的是,線粒體電子傳遞鏈的部分組成基因下調(diào)表達(dá)以及氧化還原調(diào)控過(guò)程

8、中一些清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的酶基因上調(diào)表達(dá),這暗示著轉(zhuǎn)基因植株具有較高氧化態(tài)。差異表達(dá)的基因?qū)ξ覀冞M(jìn)一步研究核黃素調(diào)控的代謝過(guò)程和防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制提供了線索。 3 轉(zhuǎn)核黃素受體基因植物抗病機(jī)制解析 基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)表明,轉(zhuǎn)基因植株線粒體電子傳遞鏈的部分基因下調(diào)表達(dá),而參與抗氧化體系中的有些基因上調(diào)表達(dá),這暗示轉(zhuǎn)基因植物可能具有較高氧化態(tài)。通過(guò)活性氧原位組織染色和葉片過(guò)氧化氫含量

9、測(cè)定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中的活性氧水平比野生型和沉默植株均高；噴施ROS供體百草枯(Paraquat)后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)百草枯表現(xiàn)較敏感,表明轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的氧化還原平衡被打破(具有較高的氧化態(tài))。為了解析轉(zhuǎn)基因植物抗病性與氧化還原平衡改變的關(guān)系,以及氧化平衡改變是否受體內(nèi)核黃素含量升高的影響,我們通過(guò)注射過(guò)氧化氫清除劑Catalase及核黃素,并結(jié)合DC3000接種,檢測(cè)不同處理中植物的氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)積累和細(xì)胞壞死這三種細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)的產(chǎn)

10、生情況,并對(duì)植物抗病性和菌落生長(zhǎng)數(shù)量進(jìn)行觀測(cè)。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的氧化還原改變對(duì)引發(fā)植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)是必需的,而且植物體內(nèi)核黃素含量的變化是引起植物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的原因。我們又利用本實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物與基本防衛(wèi)信號(hào)通路突變體npr1-1、etr1-1、etr1-1、jar1-1和abi1-1雜交或轉(zhuǎn)基因獲得的雙突變體,解析內(nèi)源核黃素介導(dǎo)的抗病性所依賴的信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雙突變體均具有較高的氧化態(tài),但接種后,npr1-1

11、中沒(méi)有顯著的活性氧積累,也沒(méi)有出現(xiàn)胼胝質(zhì)積累和細(xì)胞壞死,而其他雙突變體均產(chǎn)生增強(qiáng)的細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng),這表明內(nèi)源核黃素引發(fā)抗病防衛(wèi)反應(yīng)需要NPR1,但不依賴于乙烯、茉莉酸和脫落酸信號(hào)通路。本章的研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)高水平的核黃素引起植物體內(nèi)ROS積累及較高的氧化態(tài),使得植物進(jìn)入引發(fā)狀態(tài),當(dāng)接種病原物時(shí),轉(zhuǎn)基因植物能夠表現(xiàn)快速增強(qiáng)的細(xì)胞和分子防衛(wèi)反應(yīng),從而引發(fā)對(duì)病原菌的增強(qiáng)抗性,而且引發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程需要NPR1的參與。 4 核黃素

12、引發(fā)抗病防衛(wèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究 轉(zhuǎn)核黃素受體基因擬南芥RIRA11中氧化還原平衡狀態(tài)的改變和ROS的積累在植物抗病性中是必需的.為了證明外施核黃素是否導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原態(tài)的改變并且這一改變?cè)谝l(fā)抗病防衛(wèi)反應(yīng)中的作用,我們檢測(cè)了核黃素處理擬南芥5天內(nèi)的氧化還原動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在0小時(shí)至5天內(nèi),外源核黃素處理植物激發(fā)體內(nèi)的ROS積累且在2小時(shí)的達(dá)到高峰值,5天后恢復(fù)到原來(lái)水平；我們通過(guò)DAB染色、過(guò)氧化氫含量測(cè)定、百草枯(PQ)敏感

13、性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)核黃素處理擬南芥后導(dǎo)致氧化還原態(tài)的改變,致使體內(nèi)的氧化態(tài)升高.核黃素噴施植物后再注射Catalase,體內(nèi)的氧化態(tài)降低；而且5天后接種DC3000后,植物體內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng),其抗病性與噴施核黃素植株相比顯著降低,這表明,核黃素處理擬南芥導(dǎo)致還原狀態(tài)的改變對(duì)核黃素誘導(dǎo)的抗病性是必需的。根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)譜信息,我們選取線粒體電子傳遞鏈復(fù)合I上的兩個(gè)基因,利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)核黃素處理過(guò)程中的這兩個(gè)基因的

14、表達(dá)動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的表達(dá)明顯受抑制且在6小時(shí)表達(dá)量最低,這表明核黃素可能通過(guò)抑制線粒體電子傳遞鏈而導(dǎo)致ROS積累并打破胞內(nèi)正常的氧化還原平衡,但也不能排除是線粒體行使ROS動(dòng)態(tài)平衡初始變化的第一個(gè)轉(zhuǎn)播站并且將信號(hào)放大的結(jié)果。核黃素處理導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原平衡的改變,使植物對(duì)外來(lái)刺激更加敏感并進(jìn)入引發(fā)狀態(tài),當(dāng)病原菌侵染時(shí),植物能夠表現(xiàn)快速增強(qiáng)的細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng),這可能是核黃素引發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制。 5 防衛(wèi)反應(yīng)引發(fā)激發(fā)子引發(fā)植物

15、抗病的生產(chǎn)應(yīng)用 研究表明,水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的HpaGXooc功能片段HpaG10-42在引發(fā)水稻防衛(wèi)反應(yīng)中的活性最強(qiáng)。通過(guò)濃度/植物處理時(shí)期組合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在水稻苗期噴施一次和大田移栽后噴施三次濃度為6 μg/ml的HpaG10-42后,同對(duì)照處理相比,處理的秈稻和粳稻上水稻白葉枯病(X.oryzae pv.oryzae)和穗頸瘟(Magnaporthe gris

16、ea)的病情指數(shù)均顯著降低；而且,該濃度的蛋白在水稻苗期、返青期、分蘗后期、始穗期單獨(dú)處理一次,均可高效引發(fā)水稻在該時(shí)期的抗病性；與常規(guī)農(nóng)事操作相比,水稻生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期施用6μg/ml的蛋白處理后,兩種病害的病情指數(shù)顯著降低,在9個(gè)測(cè)試水稻品種上的誘導(dǎo)抗病效果也很顯著。結(jié)果表明,該激發(fā)子可以高效引發(fā)大田植物的抗病性,為其在田間作物上的大規(guī)模應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。 6 總結(jié) 本研究利用外源噴施核黃素及內(nèi)源核黃素調(diào)控兩種手段,對(duì)核

17、黃素引發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了初步解析,同時(shí)利用基因表達(dá)譜技術(shù),分析了內(nèi)源核黃素含量調(diào)控所影響的生理過(guò)程和代謝途徑,還對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)激發(fā)子HpaG10-42引發(fā)田間水稻抗病性進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)：第一,引發(fā)是核黃素誘導(dǎo)抗病防衛(wèi)反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制,引發(fā)病原菌刺激時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞和分子防衛(wèi)反應(yīng)依賴于NPR1,但不依賴于SA。第二,核黃素通過(guò)引起植物體內(nèi)氧化還原平衡改變而使植物進(jìn)入引發(fā)狀態(tài),但氧化還原狀態(tài)的改變不依賴于NPR1。第三,內(nèi)源核黃素