重組人胰高糖素樣肽-1突變體的串聯(lián)體與人血清白蛋白融合蛋白的純化及純度鑒定.pdf

1、本文利用構建好的重組PichiaPastorisKM71/(GLP-1A2G)2-HSA酵母工程菌株表達系統(tǒng)進行了發(fā)酵條件優(yōu)化，并對目標蛋白進行了較深入的純化工藝研究和簡單的體內(nèi)、體外活性研究。 將生產(chǎn)菌株增菌培養(yǎng)至一定菌體量后，用BMMY培養(yǎng)基懸浮菌體后定時添加甲醇進行誘導培養(yǎng)。研究表明重組PichiaPastorisKM71/(GLP-1A2G)2-HSA的最佳誘導條件為溫度30℃、pH6.0、甲醇濃度2.0％、誘導時間為6

2、0h。此最優(yōu)化條件既節(jié)省反應材料，又可以提高效率，目標蛋白的最高產(chǎn)量可達到210mg/L。 發(fā)酵液經(jīng)過4℃，10000rpm，15min離心除菌離心后，采用截留分子量為10KDa的Biomax超濾膜對發(fā)酵上清進行濃縮，濃縮倍數(shù)可達到20倍，回收率最高可達到90％。在精細分離過程中，首先將濃縮后的發(fā)酵液上Q-SeperoseFastFlow陰離子交換層析，上樣后進行階段洗脫，目標蛋白在鹽濃度達到0.1mol/L時開始被洗脫下來，回

3、收率達74％。所得到的洗脫成分處理后上HPLC檢測，結(jié)果顯示純度為90％，SDS-PAGE顯示為一條帶。將Q-Seperose陰離子交換層析后的洗脫液濃縮后上SephacrylS-200凝膠過濾，結(jié)果出現(xiàn)兩個蛋白吸收峰，經(jīng)檢測后一個峰為目標蛋白分子吸收峰。將蛋白活性峰上HPLC檢測，結(jié)果顯示純度達98％以上，經(jīng)I125標記后，采用TCA沉淀法測定放射化學純度達97％，純度優(yōu)于藥代動力學研究的要求，達到了預期純化目標。本純化工藝由發(fā)酵上清