細(xì)胞周期依賴的ApoB RNA編輯的研究.pdf

1、載脂蛋白B是乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)的必需成分，在脂類代謝、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起關(guān)鍵作用。載脂蛋白B分為:apoB-100和apoB-48。后者是前者基因轉(zhuǎn)錄后在RNA水平上經(jīng)RNA編輯產(chǎn)生的截短產(chǎn)物。ApoB-100是LDL主要蛋白組成成分，人體內(nèi)2/3的膽固醇由其作為載體以LDL形式負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)。ApoB-48是負(fù)責(zé)運(yùn)輸膳食脂類乳糜微粒的必需蛋白，也能攜帶膽固醇，但其半衰期極短，能被快速清除。血漿中低水平的apoB-100能顯著降

2、低LDL-膽固醇含量，從而可以降低基于高LDL-膽固醇的動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
　　目前，apoB RNA編輯的研究主要是在RNA水平上的研究。RNA繁瑣的實(shí)驗(yàn)方法難以實(shí)現(xiàn)高效的基于RNA編輯為靶的藥物篩選模式。ApoB RNA編輯作用于一26堿基的保守RNA序列，產(chǎn)生從CAA到UAA終止突變。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中利用該特點(diǎn)在apoB RNA編輯位點(diǎn)CAA及識(shí)別序列的兩端，連接一個(gè)紅色熒光蛋白DsRed（上游

3、）和一個(gè)綠色熒光蛋白GFP（下游），構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)的質(zhì)粒載體。以之轉(zhuǎn)染Cos-7、Caco-2和CBRH-7919細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只在Caco-2和CBRH-7919兩種編輯細(xì)胞中發(fā)生顏色的多色表達(dá)，提示RNA編輯可以由該熒光蛋白嵌合載體來指示。該研究中同種細(xì)胞的多色異質(zhì)性結(jié)果，同時(shí)提示apoBRNA編輯與細(xì)胞周期有關(guān)。
　　為了進(jìn)一步研究細(xì)胞周期對(duì)apoB RNA編輯的影響，本實(shí)驗(yàn)在瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上構(gòu)建了用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的慢病毒載體

4、。以之轉(zhuǎn)染Caco-2和CBRH-7919兩細(xì)胞系獲得了穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞株。經(jīng)秋水仙素處理及去除秋水仙素再培養(yǎng)，分別得到處于G2/M期及后期的細(xì)胞。用共聚焦顯微鏡及流式檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞周期捕獲于M期和從M期釋放后不同顏色細(xì)胞的比例。
　　在共聚焦顯微鏡下，捕獲于G2/M期的Caco-2、CBRH-7919穩(wěn)定株中紅色和黃色細(xì)胞比例較其對(duì)照有明顯下降;秋水仙素去除后細(xì)胞周期從M期釋放，紅色和黃色細(xì)胞比例得到明顯上升。通過流式細(xì)

5、胞儀定量分析發(fā)現(xiàn)，捕獲在M期的Caco-2、CBRH-7919細(xì)胞，相較于對(duì)照，其黃色細(xì)胞所占的比例明顯下降(P＜0.05);細(xì)胞從M期釋放后，相較于捕獲在M期的細(xì)胞，其黃色細(xì)胞所占比例明顯上升(P＜0.05)。流式與共聚焦檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，apoB的RNA編輯在G2/M前期受到抑制，而在中期后抑制得以釋放。為證實(shí)上述在細(xì)胞水平上的檢測(cè)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)用克隆測(cè)序法進(jìn)一步證實(shí)了在分子水平上apoB RNA編輯的發(fā)生與細(xì)胞水平一致。非常令人振奮的

6、是，當(dāng)細(xì)胞周期從M期釋放后，所有的雙核細(xì)胞都表現(xiàn)為黃色。這提示，apoB RNA編輯可能起始于細(xì)胞有絲分裂后期，通過紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)后，RNA編輯抑制被解除，重新開始編輯。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的apoB RNA編輯檢測(cè)體系，克服了瞬時(shí)表達(dá)的質(zhì)粒載體低轉(zhuǎn)染效率問題，非常均一和穩(wěn)定地反應(yīng)了細(xì)胞中apoB RNA編輯的改變，為研究apoB RNA編輯提供了一個(gè)新方法。本研究結(jié)果首次揭示了apoB RNA編輯是由細(xì)胞周期調(diào)控，提示編輯可