APOB-100 mRNA編輯的細胞異質性研究.pdf

1、載脂蛋白B是低密度脂蛋白(LDL)和乳糜微粒(CM)的必須成分，負責甘油三酯和膽固醇轉運，其中LDL是人體血漿膽固醇的主要轉運者。人體內主要有兩種形式的載脂蛋白B:Apo B-100和ApoB-48。二者產生自同一基因。ApoB mRNA編輯使ApoB-100 mRNA第6666位上的C變成了U。此處編碼谷氨酰胺的CAA密碼子變成UAA終止密碼子，導致截短的ApoB-48生成。ApoB-48形成的脂蛋白不參與LDL的形成，而更快速地得以

2、清除。血漿LDL的低水平，則降低了基于高LDL-膽固醇的動脈硬化等疾病的發(fā)生風險。對ApoB mRNA編輯的研究，顯然于RNA編輯的機制及基于高膽固醇導致的動脈硬化癥等方面的探索具有重要意義。
　　目前ApoB mRNA編輯的研究主要是基于特定細胞類型在RNA水平上的研究，是基于原始細胞材料的高背景檢測。且由于RNA提取的不穩(wěn)定、繁瑣等因素，難以實現(xiàn)RNA編輯的高通量檢測。本實驗利用ApoB mRNA編輯針對保守序列產生終止密碼子

3、的特征，構建了編輯保守序列兩側分別帶熒光蛋白(DsRed/GFP)基因的ApoB表達載體，以之轉染Caco-2和CBRH-7919細胞，發(fā)現(xiàn)轉染細胞呈現(xiàn)出綠色和黃色兩種顏色類型，提示編輯發(fā)生細胞之間存在異質性。
　　經細胞分選并對分選后的兩色細胞分別培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)綠色細胞群中出現(xiàn)了黃色細胞，而黃色細胞群里也有綠色細胞出現(xiàn)，提示編輯的細胞間異質性并非來自遺傳決定機制，而是由細胞的動態(tài)因素決定的。
　　進一步用細胞周期阻斷劑秋水仙

4、素將細捕獲在M期，轉染之后的細胞在共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩種細胞大多呈綠色，其去除秋水仙素后，繼續(xù)培養(yǎng)30小時，隨機觀察發(fā)現(xiàn)綠色細胞群體中出現(xiàn)了較多黃色的細胞。通過流式細胞儀的定量分析，M期捕獲及釋放的轉染細胞，Caco-2和CBRH-7919細胞黃色細胞占所有有色細胞的比例相比較對照分別下降了14％(p＜0.01)和6％(p＜0.01);而將細胞從M期中釋放之后，Caco-2和CBRH-7919細胞黃色細胞占所有有色細胞的比例相比較M

5、期捕獲的又顯著增加8.9％(p＜0.01)和16.8％(p＜0.01)。流式細胞儀檢測證實了激光共聚焦顯微鏡觀察的結果。兩種方法共同確證了載脂蛋白B RNA編輯的發(fā)生存在細胞異質性的特點，并指出這種異質性來自于細胞周期，即載脂蛋白B mRNA在不同細胞周期中的編輯發(fā)生情況不同。這初步提示了ApoB mRNA編輯發(fā)生的發(fā)育階段特征與細胞周期有關。
　　本實驗構建了高通量ApoB mRNA編輯檢測體系，能夠根據(jù)顏色的變化直接觀察編輯在