積雪草總苷轉(zhuǎn)化菌株的篩選及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化與鑒定.pdf

1、積雪草中的三萜皂苷具有重要的藥用價(jià)值，然而由于糖苷類藥物極性大，在消化道中的吸收差、生物利用度低，利用微生物酶水解糖苷鍵降低極性有利于提高苷類藥物的生物利用度。本文對積雪草中的三萜皂苷的微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　 通過采集不同環(huán)境的土壤樣本，分離純化得到了361株微生物，利用七葉靈顯色技術(shù)初篩得到12株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較高的菌株，根據(jù)微生物液體發(fā)酵過程中對底物積雪草總苷的轉(zhuǎn)化能力從中復(fù)篩出了1株能充分轉(zhuǎn)化積雪草總苷的微

2、生物菌株J-9。通過對菌株J-9的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察，結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行18S rDNA和ITS序列的測定及同源性分析，通過BLAST比對以及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了其種屬分類地位。菌種鑒定結(jié)果為：菌株J-9屬于半知菌綱(Deuteromyces)、絲孢菌目(Hyphomycetales)、叢梗孢科(Moni1iaceae)、青霉屬(Penicillium)。
　　 運(yùn)用薄層層析法鑒別積雪草總苷及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，通過對不同配比展開劑

3、的優(yōu)化比較，確定了最佳薄層層析展開劑，即氯仿∶甲醇∶水=10∶3∶0.2；利用硅膠柱層析法分離純化得到了2個(gè)高純度轉(zhuǎn)化產(chǎn)物A、B。通過測定熔點(diǎn)(mp)、比旋度([α]D)以及高分辨質(zhì)譜(HRMS)、紅外光譜(IR)、核磁共振碳譜(13C-NMR)、氫譜(1H-NMR)分析，鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物A、B的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為積雪草單葡萄糖苷和羥基積雪草單葡萄糖苷。其中羥基積雪草單葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)為2α，3β，6β，23α-四羥基烏蘇-12-烯-28-酸-2

4、8-0-β-D-吡喃葡萄糖酯，未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 建立了同時(shí)測定積雪草總苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物積雪草單葡萄糖苷和羥基積雪草單葡萄糖苷的HPLC檢測條件，色譜柱：Phenomex Luna C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)∶水(B)=55∶45；柱溫：30℃；檢測波長：205nm；流速：0.8ml/min；進(jìn)樣量20μl。其中，積雪草單葡萄糖苷和羥基積雪草單葡萄糖苷的進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性范圍分別為