WDR62蛋白在胃癌發(fā)生中的作用及其表達(dá)與胃癌耐藥和預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　胃癌是近發(fā)病率排名第四的惡性腫瘤，接近2/3的胃癌發(fā)生在發(fā)展中國家，而其中有42％發(fā)生在中國。盡管在胃癌的診斷方法及治療手段上已取得不少進(jìn)展，但在癌癥相關(guān)死亡率排名中，胃癌仍高居世界第二?；熓悄壳皯?yīng)用于胃癌的臨床治療方案中非常重要的一個手段，對于術(shù)后殘留癌細(xì)胞的清除、防止復(fù)發(fā)、改善預(yù)后等方面都具有積極作用。但是越來越多的臨床證據(jù)表明，目前常用于一線治療的多種藥物及多種給藥方案的總體療效評價不甚理想，為進(jìn)一步探詢內(nèi)在原

2、因及探索新的治療方案提出要求。WD重復(fù)區(qū)域62(WDR62)是最近發(fā)現(xiàn)的和中心體相關(guān)的基因，它有32個外顯子，1個CpG島和poly(A)尾。WDR62位于人類染色體19q13.12區(qū)，而且靠近CEBPG，GPI和UBA2基因的功能區(qū)，參與細(xì)胞循環(huán)與增殖等生物學(xué)過程。這些基因都已被證實(shí)在DNA復(fù)制及細(xì)胞周期中發(fā)揮極其重要的作用。WDR62蛋白有13個WD重復(fù)區(qū)域，在C末端有6個可以被絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化激活的位點(diǎn)，具有調(diào)

3、控細(xì)胞信號通路、轉(zhuǎn)錄、有絲分裂和細(xì)胞凋亡的功能。當(dāng)有絲分裂發(fā)生時，WDR62的內(nèi)源性表達(dá)大量聚集在分裂細(xì)胞的紡錘體極，而不是在細(xì)胞核周圍，提示我們WDR62在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但WDR62在人類惡性腫瘤中的作用仍然未知。本研究的目的即在于明確WDR62在人類胃癌發(fā)展與預(yù)后中的作用。
　　方法：
　　采集372例臨床胃癌患者的癌組織及癌旁胃粘膜標(biāo)本，分別進(jìn)行蘇木素伊紅（HE）染色劑免疫組織化學(xué)染色。請兩名有經(jīng)

4、驗(yàn)的病理診斷學(xué)家分別獨(dú)立閱片確認(rèn)胃腺癌的診斷。用實(shí)時熒光定量PCR及Western Blotting法檢測各組織標(biāo)本中WDR62的表達(dá)水平。采集胃癌病例的臨床病理學(xué)特征，收集隨訪資料，建立Cox回歸模型分析WDR62表達(dá)水平、臨床病理學(xué)特征與預(yù)后之間的關(guān)系。細(xì)胞培養(yǎng)8株人類胃癌細(xì)胞系(AGS，SGC7901，BGC-823，MGC-803，HGC-27，SGC7901/VCR，SGC7901/DDP和SGC7901/ADM)，用定量RT

5、-PCR及Western blotting檢測WDR62的表達(dá)水平。構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染BGC-823和多重耐藥株SGC7901/VCR細(xì)胞，研究沉默WDR62對細(xì)胞生殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力、細(xì)胞周期、凋亡發(fā)生、細(xì)胞活力、化療敏感性等的影響，并檢測WDR62，cyclin B，CDK1，caspase3及Akt、ERK等其他若干信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的mRNA及蛋白表達(dá)水平。分別用慢病毒LV-shRNA-Control and LV-shRNA-

6、WDR62轉(zhuǎn)染的BGC-823和SGC7901/VCR細(xì)胞行裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)，31天后，處死裸鼠，取出腫瘤測量其大小及重量，并行HE染色，IHC染色WDR62及Ki67。
　　結(jié)果：
　　用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測372例胃癌組織標(biāo)本及其癌旁胃粘膜組織標(biāo)本(NT)中WDR62mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的WDR62mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(0.0065±0.0016V.S.0.0027±0.00

7、09，p＜0.001)。低分化胃癌組織的WDR62mRNA表達(dá)水平要高于高分化胃癌組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.0058±0.0019 V.S.0.0022±0.00059，p＜0.001，圖1B)。免疫組化染色顯示，80.1％(298/372)的癌組織呈現(xiàn)WDR62染色陽性表現(xiàn)，23.9％(89/372)的癌旁組織有WDR62染色陽性表現(xiàn)。胃癌組織的平均IS值顯著高于癌旁組織（8.3±0.8 V.S.1.7±0.7，p＜0.01）。

8、胃癌病人WDR62表達(dá)水平比較高時，其預(yù)后情況要比低表達(dá)WDR62的病人差(平均生存時間:22.0±2.2月V.S.43.0±5.6月，p=0.003)。通過建立多變量的Cox比例風(fēng)險模型分析表明，有3個獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)影響胃癌病人的生存時間及預(yù)后，分別為癌細(xì)胞低分化水平(風(fēng)險比[HR]=2.383，p=0.009)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=1.205;p=0.012)，和WDR62高表達(dá)(HR=2.365，p=0.006)。用實(shí)時熒光定量PCR

9、與Western Blotting法檢測WDR62在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，具有多重耐藥(MDR)特性的細(xì)胞系WDR62mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著高于沒有耐藥性的細(xì)胞系（均為p＜0.01）。在耐藥株中發(fā)現(xiàn)WDR62mRNA與蛋白表達(dá)水平增高意味著WDR62可能參與胃癌化療抵抗的分子機(jī)制。用重組慢病毒轉(zhuǎn)染BGC-823和SGC7901/VCR細(xì)胞系后，侵襲轉(zhuǎn)移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LV-shRNA-WDR62與LV-shRNA-Control處理

10、后的細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移能力上沒有顯著差異。但體外沉默WDR62可抑制細(xì)胞生長，引起胃癌細(xì)胞阻滯在G2/M期而發(fā)生凋亡，LV-shRNA-WDR62轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞百分比要顯著高于LV-shRNA-Control處理組細(xì)胞（分別為7.223％±1.225％ V.S.1.576％±0.262％，5.592％±0.336％ V.S.1.617％±0.262％，均為p＜0.01)。沉默WDR62基因表達(dá)能顯著減少細(xì)胞周期蛋白B和CDK1的表

11、達(dá)水平，而使具有誘導(dǎo)凋亡作用的caspase-3表達(dá)增高。活體內(nèi)沉默WDR62可抑制胃癌細(xì)胞生長，LV-shRNA-WDR62-BGC-823組腫瘤平均大小明顯小于LV-shRNA-Control-BGC-823組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.62±0.17 cm3 V.S.3.87±0.36 cm3，p＜0.01）。與此同時，慢病毒轉(zhuǎn)染的SGC7901/VCR細(xì)胞，LV-shRNA-WDR62組腫瘤平均大小也顯著小于LV-shRNA-Co

12、ntrol組(1.52±0.12 cm3 V.S.3.96±0.29 cm3，p＜0.01)。由于LV-shRNA-WDR62組WDR62表達(dá)水平受到顯著抑制，Ki-67表達(dá)水平也隨之下降，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖速度明顯減慢。沉默WDR62基因可部分逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對化療藥物的抵抗。WDR62通過激活并調(diào)控Akt/p38-MAPK信號通路參與調(diào)控WDR62介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞多重耐藥性。
　　結(jié)論：
　　WDR62在胃癌組織