CD74基因轉(zhuǎn)染對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304特性的影響.pdf

1、CD74即MHC-Ⅱ類分子相關(guān)恒定鏈(major histocompatibility complexⅡ-associated invariant chain，Ii)，主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與新合成MHC-Ⅱ類分子連接在一起形成九聚體的輔助分子，屬Ⅱ型膜分子，與抗原提呈功能有關(guān)。近來研究還發(fā)現(xiàn)CD74可做為巨噬細(xì)胞移動抑制因子的受

2、體，與相應(yīng)細(xì)胞因子結(jié)合激活NF-κB和ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌；研究還發(fā)現(xiàn)，CD74除了表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞，與抗原提呈有關(guān)外，CD74分子還在內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞表達(dá)，與相應(yīng)疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管內(nèi)壁的單層細(xì)胞，具有分泌血管活性物質(zhì)、參與炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞游走、維持血管舒縮等多方面生物學(xué)功能。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞因具有人體血管內(nèi)皮細(xì)胞的基本特性，且新生兒臍帶來源充足、取材容易、操

3、作方便，而成為血管內(nèi)皮細(xì)胞體外研究的主要材料。ECV304是常用的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，也是研究內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性與疾病相關(guān)性的重要手段。本文將CD74基因轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞，旨在探討CD74基因在HUVEC的轉(zhuǎn)染條件和CD74基因轉(zhuǎn)染對細(xì)胞特性及功能的影響，為深入研究基于調(diào)節(jié)CD74表達(dá)的生物治療打下基礎(chǔ)。
　　 研究方法
　　 1)將含有CD74 cDNA的pCMV-CD74 EGFP熒光質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增、

4、質(zhì)粒提取、并經(jīng)酶切和測序進(jìn)行鑒定：
　　 2)將pCMV-CD74質(zhì)粒轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，通過EGFP熒光質(zhì)粒對ECV304細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染率的檢測；
　　 3)pCMV-CD74質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后ECV304細(xì)胞CD74 mRNA和CD74分子表達(dá)的鑒定：采用免疫組化法和Western blot，檢測轉(zhuǎn)染前后ECV304細(xì)胞CD74分子的表達(dá)；采用Real-time RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后CD74 mRNA水平的表

5、達(dá)；
　　 4)pCMV-CD74質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后ECV304細(xì)胞功能相關(guān)基因(HLA-A、HLA-DR、IFNGR)表達(dá)的檢測：采用Real-time RT-PCR比較轉(zhuǎn)染前后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞各功能相關(guān)基因的表達(dá)；
　　 5)應(yīng)用Real-time RT-PCR分析軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 1)在大腸桿菌擴(kuò)增后提取的質(zhì)粒經(jīng)EcorI單酶切，電泳顯示pCMV-CD74質(zhì)粒線性大小約4.7kb; E

6、corI和XbalI雙酶切可見大小約1.35kb的基因片段，與CD74 cDNA全長(1.327kb)大小符合，并經(jīng)測序分析符合CD74基因序列：
　　 2)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，并且經(jīng)過計(jì)算得出脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染率是65.8％；
　　 3)免疫組化結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，ECV304細(xì)胞CD74表達(dá)增強(qiáng)；Real-timeRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組△Ct值為4.8599，對照組△Ct值為9.2496，2

7、-△△Ct結(jié)果為20.9619大于2，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明轉(zhuǎn)染后CD74 mRNA表達(dá)顯著升高；
　　 4)Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染前后ECV304細(xì)胞HLA-A△Ct值分別為9.4881和12.1097，2-△△Ct為6.1543大于2，說明轉(zhuǎn)染前后HLA-A表達(dá)有顯著差異；IFNGR△Ct值分別為4.9828和5.5228，2-△△Ct為1.4539小于2，轉(zhuǎn)染前后無顯著差異：HLA-DR△Ct值分別為1