2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、結核病是全球死亡率和發(fā)病率最高的傳染性疾病之一,結核分枝桿菌(簡稱結核桿菌)是引起結核病的病原菌。世界衛(wèi)生組織2008年的調查報告表明,2006年全球新增920萬結核病人,有170萬人死于結核病。結核桿菌持續(xù)感染及耐藥結核桿菌的出現(xiàn)和蔓延,是目前結核病研究面臨的兩大難題,開發(fā)新型抗結核藥物迫在眉睫。
   生物信息學是現(xiàn)代藥物開發(fā)中必不可少的工具。1998年結核桿菌基因組測序的完成開啟了新型抗結核藥物研究的新時代。本論文首先利用

2、生物信息學工具分析結核桿菌基因組中功能未知的基因,在此分析過程中,發(fā)現(xiàn)了兩個新型蛋白質結構域(domain),DIM和MSTF。分析同源蛋白發(fā)現(xiàn)包含DIM domain的蛋白可能涉及細菌的致病性、信號轉導或小分子物質運輸;而MSTF domain可能在一些與細胞壁相關的過程中起作用。同時選取與結核桿菌持續(xù)感染及細胞壁合成、代謝相關的332個基因,利用生物信息學分析,最后篩選出與人及小鼠蛋白序列一致性低、在多種致病分枝桿菌中高度保守且可被

3、用來進行計算機輔助藥物設計的編碼基因66個,為本課題組深入開展新型抗結核藥物靶點的研究奠定基礎。
   結核桿菌的致病性和耐藥性與其厚且結構復雜的細胞壁有重要的聯(lián)系?;谏弦徊缴镄畔W潛在藥靶篩選的結果,本文選取與細胞壁合成相關基因galU/Rv0993和glmU/Rv1018c作為研究目標進行相關的功能研究。結核桿菌galU基因編碼UDP葡萄糖焦磷酸化酶(簡稱MtGalU),用于合成UDP葡萄糖(UDP-Glc);glmU基

4、因編碼的蛋白同時具有葡糖胺-1-磷酸鹽(GlcN-1-P)乙酰轉移酶和UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-N-GlcNAc)焦磷酸化酶活性(簡稱MtGlmU),用于合成UDP-N-GlcNAc。在本研究中,我們首先分別克隆了Rv0993和Rv1018c基因,并表達、純化獲得MtGalU和MtGlmU重組蛋白,質譜分析分子量表明兩個重組蛋白為所設計的目的蛋白。對MtGalU和MtGlmU重組蛋白比活力、最適反應條件和酶動力學參數(shù)的測定表明所獲

5、得的兩個重組蛋白分別具有相應的活性。研究發(fā)現(xiàn),具有活性的重組MtGalU蛋白為不均一的單聚體和多聚體混合物,而具有活性的重組MtGlmU蛋白為均一、穩(wěn)定的六聚體。利用兩個重組蛋白的多克隆抗體進行亞細胞定位研究,發(fā)現(xiàn)MtGalU主要定位于細胞壁,MtGlmU主要定位于細胞質中。同時利用同源模建方法模擬了MtGalU和MtGlmU的蛋白三維結構,為后期小分子化合物的虛擬篩選奠定基礎。
   基于潛在藥靶篩選結果,本文還選取與結核桿菌

6、持續(xù)感染相關的異檸檬酸裂解酶(ICL)做為潛在靶點,進行了抗結核先導化合物的篩選。首先克隆了異檸檬酸裂解酶的編碼基因icl/Rv0467,然后在大腸桿菌中表達并純化了ICL蛋白,生化驗證重組蛋白具有異檸檬酸裂解酶活性?;贗CL蛋白的晶體結構,從Specs數(shù)據(jù)庫中虛擬篩選得到能與ICL活性位點結合的小分子化合物80種,酶活性檢測表明其中67種化合物在200μg/ml的濃度下對ICL活性有抑制作用。通過體外抑菌實驗,篩選到能有效抑制模擬持

7、續(xù)感染狀態(tài)(限制碳源培養(yǎng))的結核桿菌H37Ra株和臨床耐多藥結核桿菌的先導化合物2種;其中1種化合物FD20具有較低的細胞毒性且對細胞內細菌有明顯的抑制作用。
   本論文首先利用生物信息學分析從結核桿菌蛋白質組中發(fā)現(xiàn)了兩個新型蛋白質domain,DIM和MSTF,對兩個新型domain的分析為我們了解微生物未知蛋白的功能提供啟示。同時利用生物信息學分析篩選到與持續(xù)感染及細胞壁合成、代謝相關的可作為潛在藥靶的基因66個,為本課題

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