基于生物信息學(xué)的抗結(jié)核藥物靶點的篩選與驗證.pdf

1、結(jié)核病是全球死亡率和發(fā)病率最高的傳染性疾病之一，結(jié)核分枝桿菌(簡稱結(jié)核桿菌)是引起結(jié)核病的病原菌。世界衛(wèi)生組織2008年的調(diào)查報告表明，2006年全球新增920萬結(jié)核病人，有170萬人死于結(jié)核病。結(jié)核桿菌持續(xù)感染及耐藥結(jié)核桿菌的出現(xiàn)和蔓延，是目前結(jié)核病研究面臨的兩大難題，開發(fā)新型抗結(jié)核藥物迫在眉睫。
　　 生物信息學(xué)是現(xiàn)代藥物開發(fā)中必不可少的工具。1998年結(jié)核桿菌基因組測序的完成開啟了新型抗結(jié)核藥物研究的新時代。本論文首先利用

2、生物信息學(xué)工具分析結(jié)核桿菌基因組中功能未知的基因，在此分析過程中，發(fā)現(xiàn)了兩個新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(domain)，DIM和MSTF。分析同源蛋白發(fā)現(xiàn)包含DIM domain的蛋白可能涉及細菌的致病性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或小分子物質(zhì)運輸；而MSTF domain可能在一些與細胞壁相關(guān)的過程中起作用。同時選取與結(jié)核桿菌持續(xù)感染及細胞壁合成、代謝相關(guān)的332個基因，利用生物信息學(xué)分析，最后篩選出與人及小鼠蛋白序列一致性低、在多種致病分枝桿菌中高度保守且可被

3、用來進行計算機輔助藥物設(shè)計的編碼基因66個，為本課題組深入開展新型抗結(jié)核藥物靶點的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 結(jié)核桿菌的致病性和耐藥性與其厚且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細胞壁有重要的聯(lián)系?；谏弦徊缴镄畔W(xué)潛在藥靶篩選的結(jié)果，本文選取與細胞壁合成相關(guān)基因galU/Rv0993和glmU/Rv1018c作為研究目標進行相關(guān)的功能研究。結(jié)核桿菌galU基因編碼UDP葡萄糖焦磷酸化酶(簡稱MtGalU)，用于合成UDP葡萄糖(UDP-Glc)；glmU基

4、因編碼的蛋白同時具有葡糖胺-1-磷酸鹽(GlcN-1-P)乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-N-GlcNAc)焦磷酸化酶活性(簡稱MtGlmU)，用于合成UDP-N-GlcNAc。在本研究中，我們首先分別克隆了Rv0993和Rv1018c基因，并表達、純化獲得MtGalU和MtGlmU重組蛋白，質(zhì)譜分析分子量表明兩個重組蛋白為所設(shè)計的目的蛋白。對MtGalU和MtGlmU重組蛋白比活力、最適反應(yīng)條件和酶動力學(xué)參數(shù)的測定表明所獲

5、得的兩個重組蛋白分別具有相應(yīng)的活性。研究發(fā)現(xiàn)，具有活性的重組MtGalU蛋白為不均一的單聚體和多聚體混合物，而具有活性的重組MtGlmU蛋白為均一、穩(wěn)定的六聚體。利用兩個重組蛋白的多克隆抗體進行亞細胞定位研究，發(fā)現(xiàn)MtGalU主要定位于細胞壁，MtGlmU主要定位于細胞質(zhì)中。同時利用同源模建方法模擬了MtGalU和MtGlmU的蛋白三維結(jié)構(gòu)，為后期小分子化合物的虛擬篩選奠定基礎(chǔ)。
　　 基于潛在藥靶篩選結(jié)果，本文還選取與結(jié)核桿菌

6、持續(xù)感染相關(guān)的異檸檬酸裂解酶(ICL)做為潛在靶點，進行了抗結(jié)核先導(dǎo)化合物的篩選。首先克隆了異檸檬酸裂解酶的編碼基因icl/Rv0467，然后在大腸桿菌中表達并純化了ICL蛋白，生化驗證重組蛋白具有異檸檬酸裂解酶活性?；贗CL蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，從Specs數(shù)據(jù)庫中虛擬篩選得到能與ICL活性位點結(jié)合的小分子化合物80種，酶活性檢測表明其中67種化合物在200μg/ml的濃度下對ICL活性有抑制作用。通過體外抑菌實驗，篩選到能有效抑制模擬持

7、續(xù)感染狀態(tài)(限制碳源培養(yǎng))的結(jié)核桿菌H37Ra株和臨床耐多藥結(jié)核桿菌的先導(dǎo)化合物2種；其中1種化合物FD20具有較低的細胞毒性且對細胞內(nèi)細菌有明顯的抑制作用。
　　 本論文首先利用生物信息學(xué)分析從結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)了兩個新型蛋白質(zhì)domain，DIM和MSTF，對兩個新型domain的分析為我們了解微生物未知蛋白的功能提供啟示。同時利用生物信息學(xué)分析篩選到與持續(xù)感染及細胞壁合成、代謝相關(guān)的可作為潛在藥靶的基因66個，為本課題