產(chǎn)植酸酶木霉菌的遺傳基因改良.pdf

1、植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases),是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸的一類酶的總稱。植酸酶主要存在于植物、微生物和一些動(dòng)物組織中。單胃動(dòng)物如豬、魚(yú)和家禽類不能消化植酸,飼料中加入植酸酶分解植酸,促進(jìn)單胃動(dòng)物對(duì)磷和金屬元素的吸收和利用,另外還可以降低環(huán)境中的磷污染。
　　 本文以木霉為研究對(duì)象,以各地采集木霉為基礎(chǔ)篩選高產(chǎn)植酸酶菌株。通過(guò)植酸鈣透明圈篩選法,再

2、經(jīng)過(guò)植酸酶液體發(fā)酵酶活最終選擇11號(hào)菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行基因組改組(Genome shuffiing)技術(shù)。11號(hào)菌株通過(guò)紫外誘變和亞硝基胍誘變,篩選優(yōu)良誘變子,將兩種誘變子的原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱滅活和紫外滅活,然后隨機(jī)融合,篩選融合子。
　　 紫外誘變和亞硝基胍誘變均以出發(fā)菌株為誘變菌株,選著合適的劑量進(jìn)行誘變改良。從大量的誘變子中通過(guò)初篩和復(fù)篩篩選出合適的誘變子。紫外誘變子Ⅱ的酶活為最高,且5代后培養(yǎng)未發(fā)生回復(fù)突變,酶活為1.2

3、1±0.013 U/L,將此菌株編號(hào)為UV-Ⅱ(p＜0.05)。亞硝基胍誘變中NTG-4酶活為0.94±0.014 U/L(p＜0.05)。
　　 對(duì)木霉的原生質(zhì)體制備和再生條件進(jìn)行了研究。分別考察了菌體菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度等因素對(duì)木霉原生質(zhì)制備和再生的影響。霉菌細(xì)胞壁主要成分是多糖,大多數(shù)是幾丁質(zhì)、少數(shù)種類是纖維素。以UV-Ⅱ出發(fā)菌株,以蝸牛酶為溶菌酶制備木霉原生質(zhì)體。研究得到木霉原生質(zhì)體制備條件:蝸牛酶濃度2.0

4、mg/mL,菌齡為20h,酶解時(shí)間2.0 h,酶解溫度30℃。
　　 基因組改組技術(shù)將UV-Ⅱ和NTG-4的原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱滅活和紫外滅活,然后隨機(jī)結(jié)合,使用PEG為融合劑進(jìn)行原生質(zhì)體融合。兩兩結(jié)合進(jìn)行4輪基因組改組,篩選到融合子Fu-②,酶活為2.4±0.016 U/L,比原始菌株分別高出320％。融合子遺傳特性穩(wěn)定。
　　 對(duì)融合子Fu-②進(jìn)行液體培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到優(yōu)化培養(yǎng)基Ⅱ培養(yǎng)基:葡萄糖3.0 g,可溶性淀粉