產植酸酶木霉菌的遺傳基因改良.pdf

1、植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases),是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸的一類酶的總稱。植酸酶主要存在于植物、微生物和一些動物組織中。單胃動物如豬、魚和家禽類不能消化植酸,飼料中加入植酸酶分解植酸,促進單胃動物對磷和金屬元素的吸收和利用,另外還可以降低環(huán)境中的磷污染。
　　 本文以木霉為研究對象,以各地采集木霉為基礎篩選高產植酸酶菌株。通過植酸鈣透明圈篩選法,再

2、經過植酸酶液體發(fā)酵酶活最終選擇11號菌株為出發(fā)菌株進行基因組改組(Genome shuffiing)技術。11號菌株通過紫外誘變和亞硝基胍誘變,篩選優(yōu)良誘變子,將兩種誘變子的原生質體分別進行熱滅活和紫外滅活,然后隨機融合,篩選融合子。
　　 紫外誘變和亞硝基胍誘變均以出發(fā)菌株為誘變菌株,選著合適的劑量進行誘變改良。從大量的誘變子中通過初篩和復篩篩選出合適的誘變子。紫外誘變子Ⅱ的酶活為最高,且5代后培養(yǎng)未發(fā)生回復突變,酶活為1.2

3、1±0.013 U/L,將此菌株編號為UV-Ⅱ(p＜0.05)。亞硝基胍誘變中NTG-4酶活為0.94±0.014 U/L(p＜0.05)。
　　 對木霉的原生質體制備和再生條件進行了研究。分別考察了菌體菌齡、酶濃度、酶解時間、酶解溫度等因素對木霉原生質制備和再生的影響。霉菌細胞壁主要成分是多糖,大多數是幾丁質、少數種類是纖維素。以UV-Ⅱ出發(fā)菌株,以蝸牛酶為溶菌酶制備木霉原生質體。研究得到木霉原生質體制備條件:蝸牛酶濃度2.0

4、mg/mL,菌齡為20h,酶解時間2.0 h,酶解溫度30℃。
　　 基因組改組技術將UV-Ⅱ和NTG-4的原生質體分別進行熱滅活和紫外滅活,然后隨機結合,使用PEG為融合劑進行原生質體融合。兩兩結合進行4輪基因組改組,篩選到融合子Fu-②,酶活為2.4±0.016 U/L,比原始菌株分別高出320％。融合子遺傳特性穩(wěn)定。
　　 對融合子Fu-②進行液體培養(yǎng)基優(yōu)化實驗,得到優(yōu)化培養(yǎng)基Ⅱ培養(yǎng)基:葡萄糖3.0 g,可溶性淀粉