脂質納米載體的制備與細胞轉運研究.pdf

1、固體脂質納米粒(SolidLipidNanoparticles，SLN)由甘油三酯、復合甘油酯以及蠟類等天然或合成的脂質材料制備，是繼傳統(tǒng)的乳劑、脂質體、聚合物微粒后近年來研究活躍的一種緩控釋靶向膠粒給藥系統(tǒng)。SLN具有穩(wěn)定性高、藥物泄漏少、口服生物利用度高、毒性低、能大規(guī)模生產等優(yōu)點，但同時也存在不少缺點，如有限的載藥能力、儲藏過程中藥物排擠等問題。為改善SLN的載藥能力和包封率，目前已有一些研究對傳統(tǒng)的SLN制備方法如溶劑擴散法、微

2、乳法、高壓乳勻法等方法進行了改進。 本研究引入了已在化工及生化產業(yè)中廣泛應用的“納米反應器”(nanoreactor)的概念，對SLN的制備方法進行了改進，在微小的反應空間中采用溶劑擴散法制備SLN，以獲得包封率和載藥量較高的SLN。 采用水/Tween80/Span80/正己烷組成的平均粒徑為27.1nm穩(wěn)定W/O型微乳體系，可作為制備SLN的納米反應空間。以丙酸倍氯米松(clobetasolpropionate)為模

3、型藥物，以單硬脂酸甘油酯(monostearin)作為脂質材料，考察載藥SLN的理化性質，并與用傳統(tǒng)水性溶劑擴散法制備的SLN進行比較。新方法中，較小的反應空間更有利于形成具有小粒徑分布(40.8nm和243.9nm的雙峰分布)和高載藥能力特性的SLN，在投藥量為20％時其實際載藥量可高達15.9％。體外釋放試驗表明，這種SLN的釋藥速率大于傳統(tǒng)方法制備的SLN，且藥物含量變化對釋藥曲線影響不大。 目前SLN的口服給藥方式因方便

4、、快捷、患者適應性強，已成為研究熱點，但SLN等微粒系統(tǒng)的吸收轉運受胃腸道不同部位的結構特征和生理環(huán)境的影響很大。因此，本研究以能分化出類似于小腸上皮細胞生理特性的Caco-2細胞(人體結腸腺癌細胞，thehumancolonadenocarcinomacelllines)為模型，考察了SLN給藥系統(tǒng)在Caco-2單層細胞上的跨膜轉運機理，并進一步利用腸道單向灌流的方法，對載藥SLN的在體吸收進行了研究。 研究中采用硬脂胺-異硫

5、氰基熒光素(Octadecylamine-fluoresceinisothiocyanate，ODA-FITC)作為熒光標記物，通過水性溶劑擴散法制備熒光標記的單硬脂酸甘油酯SLN。ODA-FITC以SLN作為藥物載體后，在Caco-2單層細胞上的表觀滲透系數(apparentpermeabilitycoefficient，Papp)可從1.36×10-6cm/s提高至47.3×10-6cm/s，吸收量可增加35倍，體現了SLN在提高藥

6、物轉運上的優(yōu)勢。SLN的細胞轉運存在著明顯的粒徑和濃度依賴性，粒徑越小，濃度越低，SLN的轉運能力越強。當SLN粒徑大小在100nm左右時，Papp(APtoBL)可高達287.1×10-6cm/s。采用秋水仙素抑制、空白SLN競爭等條件能夠抑制SLN在Caco-2細胞上的主動轉運。實驗結果表明，SLN從腸腔側(apical面，AP)向基底側(basolateral面，BL)進行跨細胞轉運時，細胞間隙的被動轉運和細胞吞噬攝取引導的主動轉

7、運兩種方式共同起作用。在單甘酯中加入液態(tài)油酸(Oleicacid)制備得到的納米結構脂質載體(NanostructuredLipidCarriers，NLC)，其轉運能力顯著提高，并且隨著油酸含量的增加，納米粒與細胞間的親和力逐漸增強，更利于細胞的融合和轉運，NLC的滲透系數可從47.3×10-6cm/s增加到78.7×10-6cm/s。 同時，在人體腸道的Peyer's集合淋巴小結中，存在著一種特殊的微皺褶或膜樣上皮細胞，簡稱

8、為M細胞(Membranous/microfoldcell)，其形態(tài)結構與鄰近的腸上皮細胞相比，表面微絨毛排列不整齊，已被證明是微粒給藥系統(tǒng)在體內通過Peyer's結吸收的重要途徑。本研究將培養(yǎng)至15天的Caco-2單層細胞與RajiB懸浮細胞共同孵育5天，可分化出M細胞。M細胞的吞飲小泡數量增多，跨膜電阻(transepithelialelectricalresistance，TEER)降低，因此Caco-2單層上分化出M細胞后，主動

9、吞噬能力和細胞間隙轉運途徑同時增強，SLN的轉運系數提高到未分化前單層細胞轉運的3倍。 P-糖蛋白(P-gp，P-Glycoprotein)是一種能量依賴性的“藥物溢出泵”(drugfluxpump)，在人體小腸上皮細胞和Caco-2細胞模型上均有表達。 作為主動轉運的一種方式，P-gp能夠將細胞中的藥物泵出到細胞外，使胞內藥物作用減弱或喪失，細胞由此獲耐藥性。因此，本研究也利用Caco-2細胞考察了P-gp對載藥SLN

10、轉運的影響。研究以經阿霉素刺激并產生P-gp高表達的Caco-2單層細胞為模型，可以發(fā)現阿霉素(Doxorubicin，DOX)、紫杉醇(Paclitaxel，PTX)、10-羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin，HCPT)這三種抗癌藥在轉運時都存在明顯的外排現象，即Papp(BLtoAP)＞Papp(APtoBL)，并且有2-8倍的差距，表明細胞內的藥物更傾向于被排出到腸腔側(AP)，加入P-gp抑制劑維拉帕米(Vera

11、pamil)之后，各種藥物的Papp(BLtoAP)均有所減小，且基本上接近于Papp(APtoBL)，外排的藥物量減少1-4倍，同時正向吸收轉運的量增加1-2倍。采用SLN給藥后，外排現象減弱更明顯，藥物從腸腔側(AP)向基底側(BL)的正向轉運能力可提高1-6倍，并且SLN給藥系統(tǒng)因能躲避P-gp的識別，其細胞轉運能力與包裹于其中的抗癌藥物種類無關，各種載藥SLN的Papp(BLtoAP)均在8.5×10-6cm/s左右。