微小血管參與糖尿病加重腦缺血損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察糖尿病/高血糖狀態(tài)腦缺血后，微血管數(shù)量、形態(tài)和內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變，明確微血管改變?cè)谔悄虿?高血糖加重腦缺血損傷中的作用及可能的機(jī)制，進(jìn)一步探討糖尿病/高血糖加重腦缺血損傷的可能機(jī)制。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)選取雄性SD大鼠（260-300g），隨機(jī)分成糖尿病腦缺血組（DM組）、糖尿病假手術(shù)組（DS組）、正常血糖腦缺血組（NM組）和正常血糖假手術(shù)組（NS組），腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制備1型糖尿病大鼠模型，血糖恒定高于16.

2、7mol/ml為模型成功；正常血糖組給予等體積生理鹽水腹腔注射。大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）法制備局灶性腦缺血模型（缺血30min）。再灌注1d，3d，7d，14d，28d時(shí)，采用 Longa評(píng)分法進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分后斷頸取腦；取前囟前2mm至前囟后3mm間腦組織行連續(xù)冠狀取材（厚3mm），將腦組織片于4％多聚甲醛固定用于HE和免疫組化染色；梗死區(qū)周邊大腦皮質(zhì)取材，-80℃凍存，用于western-blotting檢驗(yàn)，同時(shí)，提取相應(yīng)區(qū)

3、域腦組織置于2.5％戊二醛固定，用于電鏡檢查。 HE和PAS染色觀察腦缺血后不同灌注時(shí)間微小血管的損傷和再生；透射電子顯微鏡觀察腦缺血再灌注1d、3d、7d時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜的形態(tài)學(xué)改變；連同內(nèi)皮細(xì)胞功能蛋白vWF免疫組化染色，共同觀察缺血再灌注過程中微小血管的損傷和再生情況。免疫組化和western-blotting法檢測(cè)缺血再灌注不同時(shí)段各組缺血周邊區(qū) VEGF和VEGFR2的表達(dá)，并進(jìn)一步將VEGF和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記GF

4、AP和神經(jīng)元特異性標(biāo)記NeuN分別進(jìn)行免疫組化熒光雙標(biāo)，進(jìn)一歩明確VEGF神經(jīng)細(xì)胞定位。從而，進(jìn)一步闡明糖尿病/高血糖對(duì)腦缺血再灌注微小血管影響的可能分子機(jī)制，為高血糖加重腦缺血損傷的防治提供新思路。
　　結(jié)果:高血糖組梗死灶體積明顯大于正常血糖組（P＜0.05）。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示：假手術(shù)組結(jié)構(gòu)基本正常，MACO30 min再灌注1d時(shí)，缺血側(cè)血管管腔增大，血管和神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增大。缺血區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹，部分神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，

5、DM組以上腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞損傷的表現(xiàn)更加明顯。再灌注3d時(shí)，以上腦水腫程度減輕，缺血灶邊緣微小血管數(shù)量增加，管腔大而不規(guī)則；再灌注7d時(shí)，血管數(shù)量較3d減少，形狀逐漸恢復(fù)正常，缺血灶膠質(zhì)細(xì)胞大量堆積，膠質(zhì)結(jié)節(jié)形成；至再灌注28d時(shí)，缺血區(qū)血管無論數(shù)量或形態(tài)，與正常組比較，無明顯差異。與NM組相比較，DM組缺血側(cè)微小血管的隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，數(shù)量變化趨勢(shì)相似，但再灌注3d和7d時(shí)，缺血側(cè)邊緣血管數(shù)量明顯增多，再生的血管呈簇狀排列，部分血管

6、管壁缺如，結(jié)構(gòu)不良。PAS結(jié)果顯示：再灌注1d時(shí)血管管腔變大，基底膜變薄，較正常染色變淺，3d時(shí)，再生的血管形狀不規(guī)則，基底膜染色淺，部分基底膜斷裂，7d時(shí)基底膜開始增生、部分區(qū)域變厚，染色較1d、3d加重；再灌注14d時(shí)，血管基本恢復(fù)，基底膜較正常血管略增厚，基底膜相對(duì)完整，PAS染色加深。與NM組相比較，DM組再灌注1d時(shí)，基底膜PAS染色明顯變淡，基底膜厚薄不一現(xiàn)象明顯，有些區(qū)域甚至出現(xiàn)染色不連續(xù)。再灌注7d后，血管形狀多數(shù)不規(guī)則

7、，基底膜染色淡，部分區(qū)域缺如。電子顯微鏡觀察可見，DM組和NM組血管內(nèi)皮細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的受損情況。在DM1d時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞形成凋亡小體，基底膜內(nèi)出現(xiàn)大量空泡；再灌注3d時(shí)，新生血管管腔不規(guī)則，基底膜厚薄不一；再灌注7d時(shí)，血管壁呈增生樣增厚，血管周邊空泡較1、3d組明顯減少。血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞和構(gòu)成血管壁的星形膠質(zhì)在缺血再灌注1d時(shí)，細(xì)胞明顯水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體明顯腫脹，甚至出現(xiàn)細(xì)胞器崩解，以后逐漸恢復(fù)。高血糖組血管內(nèi)皮的受損情況較NM

8、明顯加重，血管壁周邊空泡明顯增多、變大，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯，基底膜厚薄不一更加明顯，其內(nèi)空泡大而易見，甚至出現(xiàn)基底膜斷裂，損傷表現(xiàn)以再灌注1d最為明顯。DM組缺血后內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞器損傷同樣明顯加重。內(nèi)皮細(xì)胞功能蛋白vWF免疫組化結(jié)果顯示：假手術(shù)組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見vWF均勻高強(qiáng)度表達(dá)，在NM組1d時(shí)，表達(dá)明顯下降，再灌注3d和7d時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞又出現(xiàn)不同程度表達(dá)，至缺血再灌注28d后，血管內(nèi)皮陽性表達(dá)量恢復(fù)至正常狀態(tài)。與NM組比較

9、，DM組各灌注時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞vWF表達(dá)明顯減弱。免疫組化結(jié)果顯示：VEGF主要定位于微小血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞胞漿，VEGFR2主要定位于內(nèi)皮細(xì)胞。假手術(shù)組鼠腦中僅見微量VEGF表達(dá)，DM組和NM組腦組織VEGF陽性表達(dá)主要分布于缺血周邊區(qū),VEGFR2陽性表達(dá)主要分布于缺血周邊區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。NM組和DM組大鼠腦組織中VEGF表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。VEGF表達(dá)于再灌注1d開始升高，至3d達(dá)到高峰，隨后逐漸降低，

10、隨時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸減少；至第28天僅有少量表達(dá)。與NM組相比，DM各灌注組VEGF陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05)。Western Blotting結(jié)果顯示：VEGF和VEGFR2蛋白于正常血糖腦缺血再灌注組及假手術(shù)組表達(dá)較少，自第3d有一定量的表達(dá)，第7天表達(dá)最多，之后逐漸減少，至28天仍有表達(dá)（P<0.05）。通過VEGF和GFAP和Neun免疫組化熒光雙標(biāo)結(jié)果提示，VEGF在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元均有高表達(dá)。
　　結(jié)論:1.

11、糖尿病/高血糖能加重腦組織損傷，加大梗死灶面積及微小血管損傷；微小血管損傷包括：內(nèi)皮細(xì)胞損傷，基底膜損傷和星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，參與了糖尿病/高血糖加重腦缺血損傷；
　　2.糖尿病/高血糖可促進(jìn)缺血再灌注過程中微小血管增生，但增生的血管呈簇狀生長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)不完整，可能與糖尿病/高血糖狀態(tài)，腦缺血預(yù)后不良有關(guān)；
　　3.腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)VEGF、VEGFR2的早期表達(dá)，參與了腦缺血損傷微小血管的再生；
　　4.糖尿病/高