SOCS-1對(duì)糖尿病腎損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，其早期的病理變化包括腎小球的超濾過、腎小球和腎小管上皮細(xì)胞肥大、微白蛋白尿的出現(xiàn)，伴隨腎小球和腎小管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）堆積，最終導(dǎo)致腎小球硬化和終末期腎衰竭。研究表明，細(xì)胞因子和生長因子與包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，與糖尿病腎病發(fā)病最密切的細(xì)胞因子有angiotens

2、inⅡ、MCP-1、ICAM-1、IL-6和TGF-β等。Janus kinase（JAK）/signal transducer and activators of transcription（STAT）介導(dǎo)信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)通道，可以介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，與細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等多種行為密切相關(guān)。研究證實(shí)，JAK/STAT信號(hào)通路的激活在糖尿病腎病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白（su

3、ppressors of cytokine signaling，SOCS）家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類由細(xì)胞產(chǎn)生可反饋性阻斷細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過參與負(fù)調(diào)控多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路，最終影響細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等基本生物學(xué)行為。SOCS對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用已被肯定。目前，有關(guān)SOCS對(duì)糖尿病腎損傷作用的研究鮮見報(bào)道。本研究應(yīng)用糖尿病小鼠模型和高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，從整體、細(xì)胞和分子等不同水平，系統(tǒng)觀察了

4、SOCS-1基因過表達(dá)對(duì)糖尿病腎臟細(xì)胞的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.小鼠糖尿病模型的制備及活體SOCS-1基因轉(zhuǎn)染
　　 CD-1雄性小鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（N）、糖尿病組（DM）、糖尿病+空質(zhì)粒組（DM+V）和糖尿病+SOCS-1質(zhì)粒組（DM+S1）。DM、DM+V與DM+S1組小鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素150mg/kg（STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5），對(duì)照

5、組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72h后測(cè)定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++者確定為DM模型。DM+S1組小鼠給予尾靜脈快速注射pEF-FLAG-I/mSOCS-1質(zhì)粒（1 mg/kg）；DM+V組用同種劑量和方法注射pEF-FLAG-I空質(zhì)粒。此后每隔7天注射一次，于STZ注射后4周每組取6只小鼠，切取腎臟。取部分腎皮質(zhì)組織置于4％多聚甲醛固定用于光鏡觀察及免疫組織化學(xué)染色；部分腎皮質(zhì)組織用于提取蛋白

6、及RNA。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)F4/80、MCP-1、ICAM-1和TGF-β1的表達(dá)；Western blot檢測(cè)SOCS-1、p-STAT1、MCP-1、ICAM-1及TGF-β1的表達(dá)；半定量RT-PCR檢測(cè)TGF-β1和MCP-1 mRNA的表達(dá)。
　　 2.過表達(dá)SOCS-1系膜細(xì)胞系的建立及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)
　　 應(yīng)用脂質(zhì)體2000，將pCR3.1/SOCS-1及pCR3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人系膜細(xì)胞（HMC），2

7、4h后用G418（0.5 mg/ml）篩選陽性克?。ü埠Y選4周），建立穩(wěn)定表達(dá)SOCS-1人系膜細(xì)胞系。無血清RPMI-1640培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h，分別用NG（5.5mmol/L葡萄糖）、HG（30mmol/L葡萄糖）和NG+M（24.5mmol/L甘露醇）刺激，于1、2、4、6、12、24和48h收集細(xì)胞及上清液，提取總蛋白及RNA。Western blot方法檢測(cè)系膜細(xì)胞SOCS-1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、

8、JAK2、STAT1和STAT3的表達(dá)情況；半定量RT-PCR方法檢測(cè)系膜細(xì)胞SOCS-1 mRNA及TGF-β1 mRNA的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清TGF-β1和FN的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.過表達(dá)SOCS-1糖尿病小鼠腎皮質(zhì)單核/巨噬細(xì)胞浸潤、MCP-1、ICAM-1及TGF-β1表達(dá)
　　 ①免疫組化顯示：與正常對(duì)照組（N組）相比，DM和DM+V組F4/80陽性細(xì)胞、MCP-1、ICAM-1和

9、TGF-β1蛋白表達(dá)顯著增加；DM+S1組則明顯低于DM+V組。②Western blot結(jié)果顯示：與N組比較，DM和DM+V組MCP-1、ICAM-1及TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高，DM和DM+V組之間無明顯差異；DM+S1組各指標(biāo)的蛋白表達(dá)則明顯低于DM和DM+V組。③RT-PCR結(jié)果顯示：與N組比較，DM和DM+V組MCP-1和TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；DM+S1組則顯著降低。
　　 2.高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人系膜細(xì)

10、胞JAK/STAT信號(hào)的激活以及SOCS-1、TGF-β1和FN的表達(dá)
　　 ①Western blot結(jié)果顯示：高糖刺激系膜細(xì)胞1h，SOCS-1蛋白表達(dá)明顯升高，4h達(dá)到峰值，然后逐漸減低，24h達(dá)基線水平。高糖刺激系膜細(xì)胞JAK2、STAT1和STAT3蛋白磷酸化明顯增強(qiáng)，12-24h達(dá)高峰，持續(xù)至48h。SOCS-1轉(zhuǎn)染組JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化水平低于對(duì)照組。②RT-PCR結(jié)果顯示：高糖刺激系膜細(xì)胞1h

11、，SOCS-1 mRNA表達(dá)明顯升高，4h達(dá)峰值，然后逐漸降低，24h達(dá)基線水平。高糖刺激48h，與對(duì)照組相比，系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)；SOCS-1轉(zhuǎn)染組TGF-β1 mRNA表達(dá)降低。③高糖刺激48h的系膜細(xì)胞上清液中TGF-β1和FN蛋白含量增加，與對(duì)照組差異顯著；SOCS-1轉(zhuǎn)染組的上清中TGF-β1和FN含量明顯減少。
　　 結(jié)論：
　　 1.腎臟過表達(dá)SOCS-1基因能夠減輕糖尿病早期腎