抑制SGLT2對(duì)糖尿病腎損傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活的提高，全球范圍內(nèi)糖尿病，特別是Ⅱ型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)患者急劇增長(zhǎng)。糖尿病正在成為危害大眾健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。糖尿病可導(dǎo)致多種并發(fā)癥，糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，臨床上，超過(guò)40％的終末期腎病(end stage renal dis

2、ease，ESRD)由糖尿病引起。為此，研究糖尿病致腎臟損傷機(jī)制成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的重要課題。
　　盡管目前有很多治療糖尿病藥物，但長(zhǎng)期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，這些藥物對(duì)并發(fā)癥的發(fā)生、靶器官的損傷并沒(méi)有確切的保護(hù)作用，甚至部分藥物有明顯的副作用。例如，雙胍類(lèi)藥物容易引起消化道癥狀，特別是在老年患者中容易引起乳酸中毒;磺脲類(lèi)藥物和胰島素容易引起低血糖和肥胖。Ⅱ型糖尿病是進(jìn)行性疾病，隨著疾病的發(fā)展，胰腺分泌胰島素能力因衰竭而不斷下降，病情加重，

3、血糖失去控制，現(xiàn)行藥物只能通過(guò)增大劑量或者添加其他降糖藥物聯(lián)合治療，這就增加了治療方案的復(fù)雜度和風(fēng)險(xiǎn)，為此，研發(fā)新的治療糖尿病藥物成為迫切需求。
　　腎臟在葡萄糖穩(wěn)態(tài)（glucose homeostasis）中發(fā)揮重要作用。健康成年人腎小球每天濾過(guò)將近180g葡萄糖，其中大部分被腎臟重吸收，剩下不足0.5g通過(guò)尿液排出體外。家族性腎性糖尿(familial renal glycosuria，F(xiàn)RG)有尿糖增多的臨床表現(xiàn)，但這種病人

4、的血糖濃度和腎功能無(wú)明顯異常。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是這類(lèi)病人腎臟SLCA2基因發(fā)生突變，SGLT2功能受到損害。
　　SGLT2(sodium-glucose cotransporter2)是高容量、低親和力的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，分布在腎臟近端小管細(xì)胞腔面膜，小管液中葡萄糖通過(guò)SGLT2進(jìn)入細(xì)胞后，又能被位于小管上皮細(xì)胞基底膜上的GLUT(Glucose transporter)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，經(jīng)間質(zhì)進(jìn)入小管周?chē)?xì)血管網(wǎng)中，從而完成腎小管對(duì)葡萄糖

5、的重吸收。SGLT2主要分布于近端小管的前段，與基底膜側(cè)的GLUT2配合，重吸收葡萄糖，正常生理狀態(tài)下，約90％濾過(guò)的葡萄糖經(jīng)SGLT2重吸收，剩余10％由位于遠(yuǎn)端小管的SGLT1重吸收。
　　SGLT2特異性分布在腎臟，抑制SGLT2對(duì)其它組織器官糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用無(wú)顯著影響。自然界存在天然的SGLT2抑制劑根皮苷(phlorizin)，它最初是在蘋(píng)果樹(shù)皮的提取物中發(fā)現(xiàn)的。由于根皮苷口服幾乎不吸收、選擇性差等原因，沒(méi)有被開(kāi)發(fā)成抗糖尿

6、病藥物，但以它為前體化合物，開(kāi)發(fā)了許多新結(jié)構(gòu)的SGLT2抑制劑，部分藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。
　　SGLT2抑制劑通過(guò)增加尿糖排泄從而降低血糖，是一種新型降糖藥物，因其作用機(jī)制為非胰島素依賴，理論上可作為其他抗糖尿病藥物的補(bǔ)充、輔助藥物，用于各類(lèi)型、各個(gè)階段的糖尿病治療。
　　糖尿病病人機(jī)體血糖異常升高，使體內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境中，引起氧化應(yīng)激、非酶糖基化、多種炎癥和細(xì)胞因子過(guò)度激活，進(jìn)而導(dǎo)致靶器官損傷。那么，抑制SGL

7、T2后，通過(guò)增加尿糖排出，降低血糖對(duì)糖尿病、糖尿病引起的腎損傷有什么影響，什么因素參與SGLT2抑制劑對(duì)腎臟的影響等成為本課題研究的問(wèn)題。
　　為此，本實(shí)驗(yàn)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠和db/db小鼠動(dòng)物模型中，觀察抑制SGLT2對(duì)糖尿病腎損害的作用，并進(jìn)一步探討其發(fā)生機(jī)制。
　　課題研究由以下兩部分組成:
　　一、抑制SGLT2對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎損傷的作用及機(jī)制
　　1、正常SD大鼠腹腔注射STZ造成糖尿病

8、模型成功后，大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)2周后開(kāi)始給藥，給藥時(shí)間為期六周。實(shí)驗(yàn)分成五組:正常組(Con)、Dapa處理組(Con+Dapa)、模型組(DM)、Dapa處理組(DM+Dapa)及陽(yáng)性對(duì)照組(DM+Cande)。各組分別觀察大鼠血糖、尿糖、尿量、腎重/體重比變化。DM組血糖、尿糖、尿量、腎重/體重比明顯升高，DM+Dapa組大鼠血糖顯著降低，尿糖、尿量進(jìn)一步升高，腎重/體重比降低。DM+Cande組大鼠血糖、尿糖、尿量沒(méi)有明顯改變，腎重/體

9、重比降低。DM組、DM+Dapa組、DM+Cande組大鼠之間體重沒(méi)有差異，Con組和Con+Dapa組大鼠之間體重沒(méi)有差異。這證實(shí)抑制SGLT2可以通過(guò)增加尿糖排泄降低血糖。
　　2、通過(guò)Western blot觀察到，DM組大鼠SGLT2蛋白表達(dá)水平相比Con組升高，Con+Dapa組和DM+Dapa組SGLT2蛋白表達(dá)水平相比Con組顯著升高。DM+Cande組大鼠SGLT2蛋白表達(dá)水平相比Con組升高，相比DM組沒(méi)有變化。

10、
　　3、DM組大鼠24小時(shí)尿蛋白、血漿尿素氮、肌酐相比Con組明顯升高，DM+Dapa組和DM+Cande組大鼠24小時(shí)尿蛋白、血漿尿素氮、肌酐相比DM組顯著降低。光鏡下，PAS染色DM組基底膜有所增厚，DM組腎小球體積有所增大，系膜細(xì)胞有所增生，但變化不顯著;HE染色各組均未見(jiàn)明顯的結(jié)構(gòu)差別和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);Masson染色各組均未見(jiàn)明顯的膠原沉積。電鏡下觀察到DM組腎小球基底膜有局部增厚，部分上皮足突有融合，其余結(jié)構(gòu)未見(jiàn)病變，

11、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常。通過(guò)Western blot觀察腎臟膠原蛋白CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平，DM組CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平顯著升高，DM+Dapa組和DM+Cande組大鼠相比DM組CollagenⅠ水平的升高明顯減少。這些結(jié)果提示抑制SGLT2可以延緩糖尿病腎損傷。
　　4、DM組大鼠糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)、丙二醛(MDA)、TGF-β水平顯著上升，DM

12、+Dapa組和DM+Cande組能夠減少AGEs、MDA、TGF-β的升高，提示AGEs、MDA、TGF-β可能參與抑制SGLT2對(duì)腎損傷的保護(hù)作用。
　　二、抑制SGLT2對(duì)db/db糖尿病小鼠腎損傷的作用及機(jī)制
　　1、C57BL/6小鼠和db/db小鼠適應(yīng)環(huán)境一周后開(kāi)始給藥，給藥時(shí)間為期六周。實(shí)驗(yàn)分成五組:正常組(Con)、Dapa處理組(Con+Dapa)、模型組(DM)、Dapa處理組(DM+Dapa)及陽(yáng)性對(duì)照組

13、(DM+Cande)。各組分別觀察小鼠血糖、體重的變化。DM組小鼠相比Con組小鼠血糖明顯升高，體型肥胖，體重增加，DM+Dapa組小鼠相比DM組血糖明顯降低，體重減輕;DM+Cande組小鼠相比DM組血糖、體重沒(méi)有明顯變化。Con+Dapa組小鼠相比Con組血糖沒(méi)有明顯變化，體重減輕。這證明SGLT2抑制劑能夠降低血糖和Ⅱ型糖尿病的體重增加。
　　2、通過(guò)Western blot觀察到DM組小鼠SGLT2蛋白表達(dá)水平相比Con組

14、升高，Con+Dapa組和DM+Dapa組SGLT2蛋白表達(dá)水平相比Con組顯著升高。DM+Cande組大鼠SGLT2蛋白表達(dá)水平相比Con組升高，相比DM組沒(méi)有變化。
　　3、小鼠各組間尿素氮、肌酐水平均未見(jiàn)顯著差異，這是由于db/db小鼠糖尿病一般在糖尿病發(fā)生10周后相關(guān)指標(biāo)才開(kāi)始發(fā)生改變。DM組PAS染色基底膜有所增厚，但變化不顯著。通過(guò)Western blot觀察腎臟膠原蛋白CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平，DM組Colla

15、genⅠ蛋白表達(dá)水平相比Con組顯著升高，DM+Dapa組和DM+Cande組相比DM組CollagenⅠ水平的升高明顯減少。這提示抑制SGLT2可以延緩糖尿病腎損傷。
　　4、DM組糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)、丙二醛(MDA)、TGF-β水平相比Con組顯著升高，DM+Dapa組和DM+Cande組能夠減少AGEs、MDA、TGF-β的升高，提示AGEs、MDA、TG