CXCR1-2拮抗劑G31P對(duì)糖尿病腎病小鼠腎損傷的作用研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病(DN)是由糖尿病(DM)患者高血糖引發(fā)的一種微血管病變，是DM最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。隨著對(duì)DN研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)炎癥在DN的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。CXCL8與其趨化因子受體(CXCR1/2)結(jié)合，招募中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)。CXCL8(3-72) K11R/G31P(以下簡(jiǎn)稱(chēng)G31P)，作為CXCR1/2受體拮抗劑，可與CXCL8競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CXCR1/2受體，從而抑制 CXCL8的生

2、物學(xué)活性，發(fā)揮其抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立 DM小鼠模型，來(lái)探討G31P對(duì)DN腎損傷的抑制作用。
　　方法：
　　1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.1建立DM小鼠模型并分組：實(shí)驗(yàn)選取6周齡的C57BL/6J雄性小鼠，通過(guò)高脂飲食(HFD)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法，建立DM小鼠模型。根據(jù)研究?jī)?nèi)容將實(shí)驗(yàn)分成以下四組：正常對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Cntl組)、Cntl+G31P組、DM組和DM+G31P組。其中，Cntl+G31P組和

3、DM+G31P組給予小鼠皮下注射G31P，劑量為0.5 mg/kg，兩天一次，而Cntl組和DM組注射相同體積的生理鹽水，治療周期為1個(gè)月。
　　1.2動(dòng)物組織樣本采集：治療期間，每周監(jiān)測(cè)各組小鼠的體重、進(jìn)食量、飲水量、尿量和血糖等變化情況。治療一個(gè)月后，處死全部小鼠，采集和處理小鼠標(biāo)本：小鼠眼球取血，室溫靜置1 h后，離心取血清，-80℃分裝保存。剝離小鼠體內(nèi)雙側(cè)腎臟組織，稱(chēng)重并拍照。
　　1.3實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：部分腎臟組織用4

4、%多聚甲醛溶液固定，行H&E、過(guò)碘酸雪夫(PAS)、天狼猩紅(Sirius red)和免疫組織化學(xué)(IHC)等染色：H&E染色觀察腎臟組織病理結(jié)構(gòu)，PAS染色觀察腎小球硬化程度，Sirius red染色觀察膠原沉積情況，IHC檢測(cè)腎臟組織中Collagen IV、MPO、F4/80、p-NF-kB、CXCR1、CXCR2、Podocin和Nephrin的表達(dá)情況；部分腎臟組織用3%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定，電鏡(TEM)觀察腎臟組織

5、腎小球基底膜厚度(GBM)厚度和足突融合情況；其余腎臟組織用于提取RNA和蛋白，RT-PCR檢測(cè)炎癥及纖維化相關(guān)因子的表達(dá)情況，Western blotting檢測(cè)信號(hào)通路中ERK1/2、JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表達(dá)水平等。
　　2體外實(shí)驗(yàn)：
　　2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞(HRMCs)，將6-15代HRMCs分成以下四組：(a)正常血糖組(NG組)，細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；(b)甘露醇組(M

6、C組)，細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基中加24.4 mM的甘露醇做高滲對(duì)照；(c)高糖組(HG組)，細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基中加24.5 mM的葡萄糖刺激；(d) G31P治療組(HG+G31P組)，細(xì)胞在高糖刺激前1 h加100 ng/ml的G31P預(yù)處理。
　　2.2實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G31P對(duì)HRMCs的細(xì)胞毒性作用；RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中CXCL8、TNF-a、TGF-β和CTGF的表達(dá)水平；Western blotting

7、檢測(cè)各組HRMCs信號(hào)通路中ERK1/2、JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.1 G31P對(duì)DM小鼠腎臟具有保護(hù)作用：觀察腎臟大小并計(jì)算腎臟/體重比值發(fā)現(xiàn)，G31P治療可改善DM引起的腎臟肥大癥狀，腎臟/體重比值降低(P<0.01)；DM小鼠的血糖、進(jìn)食量、飲水量和尿量均顯著升高，G31P治療后DM小鼠的飲水量和尿量顯著減少(P<0.01)；G31P治療可顯著降低DM小鼠的B

8、UN、Ccr和UACR水平(P<0.01)；H&E染色觀察發(fā)現(xiàn)，DM組小鼠腎小球肥大，系膜基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞肥大、空泡變性、萎縮及壞死。G31P治療后腎小管和腎小球損傷減輕。TEM觀察發(fā)現(xiàn)，DM組小鼠基底膜呈現(xiàn)不同程度彌漫性增厚，足突增寬、融合甚至消失，足突細(xì)胞數(shù)量減少，G31P治療后腎臟組織病理改變得到明顯緩解；RT-PCR和IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，與Cntl組相比，DM組腎臟Nephrin和Podocin表達(dá)水平顯著下降，G

9、31P部分恢復(fù)二者表達(dá)水平(P<0.05)。
　　1.2 G31P抑制DM小鼠腎臟組織炎癥反應(yīng)：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DM組小鼠IL-1β、IL-6和 TNF-α表達(dá)量顯著增加，G31P治療可顯著降低三者表達(dá)水平(P<0.01)；IHC染色觀察發(fā)現(xiàn)，NF-κB、MPO和F4/80在DM組小鼠的腎臟組織中表達(dá)顯著增高，G31P治療后三者表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；ELISA、RT-PCR和IHC等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CXCL8、CX

10、CR1和CXCR2在DM組小鼠血清或腎臟組織中表達(dá)顯著上升，G31P治療后三者水平均有不同程度的下降(P<0.05、P<0.01)；Western blotting結(jié)果顯示，ERK1/2、JAK2和STAT3的磷酸化蛋白水平在DM組表達(dá)顯著升高，G31P治療后三者表達(dá)量顯著下降(P<0.05、P<0.01)。
　　1.3 G31P改善DM小鼠腎臟組織的纖維化：PAS染色結(jié)果顯示，DM小鼠腎臟組織內(nèi)PAS陽(yáng)性染色物質(zhì)明顯增多，腎小球

11、硬化指數(shù)(GSI)升高，G31P治療后，GSI水平明顯降低(P<0.01)；Sirius red染色觀察發(fā)現(xiàn)，G31P治療可顯著改善DM小鼠腎臟組織內(nèi)的膠原沉積情況(P<0.01)；IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DM小鼠Collagen IV表達(dá)水平比Cntl組明顯升高，G31P治療后，其表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；RT-PCR和Western blotting研究結(jié)果顯示，DM組小鼠腎臟組織高表達(dá)TGF-β和CTGF，G31P治療后二者表達(dá)水

12、平顯著下降(P<0.05、P<0.01)。
　　2體外實(shí)驗(yàn)
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：適當(dāng)劑量的G31P對(duì)系膜細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，表明其沒(méi)有細(xì)胞毒性；RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在HRMCs中，與NG組相比，HG組TNF-α、TGF-β和 CTGF表達(dá)量顯著升高，G31P治療顯著降低三者 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)。另外，在30 mmol/L高糖刺激下，CXCL8的mRNA表達(dá)量顯著增高，峰值在刺激6 h后出現(xiàn)；高糖刺

13、激可誘導(dǎo)HRMCs中ERK1/2、JAK2和STAT3的磷酸化蛋白表達(dá)增高，G31P治療后三者表達(dá)量顯著下降(P<0.05、P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　(1) DN小鼠腎臟組織中炎性細(xì)胞大量聚集，炎癥相關(guān)因子表達(dá)明顯升高，推測(cè)炎癥在DN的發(fā)生和發(fā)展中起到非常重要的作用。
　　(2)通過(guò)與CXCR1/2受體結(jié)合，G31P能夠減輕DN小鼠的腎臟組織損傷，減少促炎和促纖維化因子的表達(dá)，發(fā)揮其腎臟保護(hù)作用，為臨床上治療