炎癥在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子SOCS-1、SOCS-3的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，是引起終末期腎衰的主要原因之一。DN的發(fā)病機制非常復(fù)雜，糖脂代謝紊亂、腎臟血流動力學(xué)改變、多種細(xì)胞因子及遺傳背景均起重要作用。
　　 DN的病理變化復(fù)雜，早期主要表現(xiàn)為腎小球和腎小管的肥大，晚期則出現(xiàn)腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。腎小管間質(zhì)纖維化是各種不同病因的慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭時的共同病理變化。且腎小管間質(zhì)纖維化的程度與腎功

2、能的相關(guān)性比腎小球硬化與腎功能的相關(guān)性更為密切，是慢性腎病進(jìn)展至終末期腎衰的特征。其中肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要。α-平滑肌肌動蛋白（a-smooth muscleactinα-SMA）陽性的肌成纖維細(xì)胞是一種具有平滑肌細(xì)胞特性的成纖維細(xì)胞，是腎間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。正常腎組織中幾乎無肌成纖維細(xì)胞，但在多種病理狀態(tài)下，腎組織中可出現(xiàn)較多肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞可來源于成纖維細(xì)胞的分化，血管外周細(xì)胞

3、的遷移，也可來自于腎小管上皮細(xì)胞。因此探討DN腎間質(zhì)中炎細(xì)胞浸潤、炎癥因子的產(chǎn)生及其作用機制，可為DN的抗炎治療提供理論依據(jù)。
　　 白介素-1（inter leukin-1，IL-1）是非常重要的炎癥介質(zhì)，其中IL-1β可抑制人近端小管上皮細(xì)胞增生、誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷并促使其表達(dá)α-SMA，上調(diào)纖維粘連蛋白的合成，從而促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化。抑瘤素M（OncostatinMOSM）是繼IL-6、TNF、白血病抑制因子等后發(fā)現(xiàn)

4、的一種具有重要生物學(xué)意義的細(xì)胞因子，可參與炎癥反應(yīng)等。最近體外研究表明OSM可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；可見IL-1β和OSM均可參與腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，但有關(guān)二者在DN腎組織中的表達(dá)及其作用的研究鮮見報道。
　　 本研究應(yīng)用糖尿病小鼠模型和體外培養(yǎng)的人腎近曲小管上皮細(xì)胞（HKC），從整體、細(xì)胞和分子等不同水平，系統(tǒng)觀察糖尿病腎病早期腎組織中單核巨噬細(xì)胞浸潤及炎癥因子IL-1β、OSM的表達(dá)情況，及在IL-1β或OSM刺

5、激下腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的情況，從而探討炎癥在糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)病機制中的作用；此外我們應(yīng)用體內(nèi)外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察SOCS-1、SOCS-3過表達(dá)時糖尿病小鼠腎組織炎癥狀態(tài)及SOCS-1、SOCS-3過表達(dá)對IL-1β或OSM刺激的HKC轉(zhuǎn)分化的影響，進(jìn)一步探討SOCS-1、SOCS-3基因在DN炎癥發(fā)病機制中的作用，以期為進(jìn)一步闡明糖尿病腎病發(fā)病的分子機制及其防治提供一條新的思路。
　　 方法：
　　 1、

6、小鼠糖尿病模型的制備及腎組織中角蛋白18（cytokeratin18，CK18）、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1、CD68、IL-1β和OSM的檢測雄性CD-1小鼠行右腎切除術(shù)，傷口愈合后將實驗動物隨機分為兩組：對照組（N）和糖尿病組（DM）。
　　 2、HKC培養(yǎng)及CK18、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1及I型膠原（collagenIColl）和纖維連接蛋白（fibronecti

7、nFN）的檢測體外培養(yǎng)HKC，用含10％胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，刺激前先用無血清DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h，之后將細(xì)胞分成5組。
　　 3、體外SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染及CK18、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1、ColI和FN的檢測應(yīng)用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將PCR3.1-SOCS-1、PCR3.1-SOCS-3真核表達(dá)載體

8、轉(zhuǎn)染入HKC，經(jīng)G418（0.5mg/ml）篩選，建立HKCSOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞系，細(xì)胞分成9組。
　　 4、體內(nèi)轉(zhuǎn)染SOCS-1、SOCS-3基因及CK18、α-SMA、SOCS-1、SOCS-3、p-STAT1、CD68、IL-1β和OSM檢測雄性CD-1小鼠行右腎切除術(shù)，傷口愈合后將實驗動物隨機分為5組。
　　 結(jié)果：
　　 1、糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與腎組織炎癥反應(yīng)情況①光鏡

9、下觀察，糖尿病組與對照組小鼠腎組織相比腎小球體積增大，系膜基質(zhì)輕度增多，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。②免疫組化結(jié)果顯示，CK18主要定位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，對照組腎組織中α-SMA蛋白僅定位于血管平滑肌細(xì)胞漿內(nèi)，呈強陽性。與對照組相比，糖尿病組小鼠腎小管上皮細(xì)胞CK18蛋白及mRNA的表達(dá)逐漸減少并出現(xiàn)逐漸增強的α-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)。③SOCS-1、SOCS-3蛋白在對照組腎組織中僅見少量表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞

10、胞漿。與對照組相比，糖尿病組SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的表達(dá)增強，在糖尿病4周時表達(dá)最強，之后逐漸下降，但仍高于對照組。④與對照組相比，糖尿病組p-STAT1的表達(dá)水平增高，4周時表達(dá)最強，之后逐漸下降，12周時與正常對照組無明顯差異。⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CD68（巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白）在糖尿病小鼠腎組織的表達(dá)明顯高于對照組；ELISA結(jié)果顯示，糖尿病小鼠腎組織中IL-1β和OSM的表達(dá)明顯高于對照組。
　　 2

11、、細(xì)胞因子IL-1β或OSM對HKC中SOCS-1、SOCS-3表達(dá)及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化影響①透射電鏡觀察，與對照組相比，IL-1β或OSM刺激后HKC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，線粒體明顯減少，部分嵴消失，刺激72h后，HKC內(nèi)出現(xiàn)肌動蛋白絲。②SOCS-1、SOCS-3蛋白主要在HKC胞漿表達(dá)，與對照組比較，IL-1β及OSM刺激組SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的表達(dá)均增多，刺激24h表達(dá)最強，之后逐漸下降，但仍高于對照組。AG490可部

12、分抑制二者蛋白及mRNA的表達(dá)。③在IL-1β或OSM刺激下，CK18蛋白及mRNA的表達(dá)逐漸減少，而α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)逐漸增強。細(xì)胞因子刺激的同時加入AG490能部分逆轉(zhuǎn)二者的改變。④IL-1β和OSM均可激活STAT1，使p-STAT1水平上升，加入AG490干預(yù)可明顯抑制p-STAT1的表達(dá)。⑤ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比，IL-1β和OSM組細(xì)胞上清液中ColI和FN的分泌逐漸增多，而AG490干預(yù)可明顯抑制其分

13、泌。
　　 3、SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染及二者對IL-1β或OSM刺激HKC表型轉(zhuǎn)分化的影響①提取的PCR3.1-SOCS-1、PCR3.1-SOCS-3質(zhì)粒經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒電泳圖譜條帶相符。②SOCS-1、SOCS-3轉(zhuǎn)染組其各自的蛋白和mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組和空載體轉(zhuǎn)染組，表明SOCS-1、SOCS-3基因成功導(dǎo)入HKC，并在蛋白水平獲得高效表達(dá)。③免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernb

14、lot和RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與IL-1β及OSM刺激組相比，SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染能明顯上調(diào)CK18蛋白和mRNA的表達(dá)，同時抑制IL-1β及OSM誘導(dǎo)的α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)。此外SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染能抑制IL-1β及OSM誘導(dǎo)的p-STAT1蛋白的表達(dá)；ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中ColI和FN蛋白的分泌明顯減少。
　　 4、S

15、OCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染對糖尿病小鼠腎臟炎癥狀態(tài)及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響①與糖尿病組相比，SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染組小鼠腎組織中SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增強，提示SOCS-1、SOCS-3基因成功導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，并在蛋白水平獲得高效表達(dá)。②CK18和α-SMA蛋白檢測結(jié)果顯示，SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染能明顯抑制腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)并逐漸恢復(fù)CK18的表達(dá)。⑨RT-PCR

16、結(jié)果顯示，SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染能抑制腎小管上皮細(xì)胞中α-SMAmRNA的表達(dá)并使CK18mRNA表達(dá)有所恢復(fù)明顯。⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞的標(biāo)志蛋白CD68，結(jié)果顯示，SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染可抑制CD68的表達(dá)。⑥ELISA結(jié)果顯示，SOCS-1、SOCS-3基因轉(zhuǎn)染后腎組織中IL-1β和OSM蛋白的表達(dá)明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 ①糖尿病小鼠腎組織中存在巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子IL-1β、O

17、SM及p-STAT1表達(dá)的增多，同時存在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，提示糖尿病腎組織存在炎癥反應(yīng)、小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及JAK/STAT。信號通路的激活。
　　 ②IL-1β、OSM可刺激腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA并抑制CK18的表達(dá)，同時使p-STAT1的表達(dá)增多。而同時應(yīng)用AG490干預(yù)可降低α-SMA和p-STAT1的的表達(dá)，并使CK18的表達(dá)部分恢復(fù)。提示IL-1β和OSM可通過激活JAK/STAI信號通路誘導(dǎo)腎近曲小管上

18、皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。
　　 ③SOCS-1、SOCS-3過表達(dá)能抑制IL-1β、OSM誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞α-SMA和p-STAT1的表達(dá)，提示SOCS-1、SOCS-3基因可能通過對JAK/STAT信號途徑的負(fù)反饋作用而抑制IL-1β、OSM誘導(dǎo)的HKC轉(zhuǎn)分化。
　　 ④過表達(dá)SOCS-1、SOCS-3基因能抑制巨噬細(xì)胞浸潤、抑制炎癥因子IL-1β和OSM的表達(dá)，同時降低腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，提示S