游離甲狀腺素與游離三碘甲狀腺原氨酸的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 人體血清中的甲狀腺素(Thyroxine，T4)和三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)絕大部分是與甲狀腺結(jié)合球蛋白(thyroxine-bindingglobulin，TBG)、甲狀腺結(jié)合前白蛋白(Thyroxine-binding prealbumin，TBPA)和白蛋白結(jié)合，僅有約0.03％的T4和0.3％的T3以游離的狀態(tài)存在。然而，正是這些極微量的游離分子(FT4，F(xiàn)T3)發(fā)揮著

2、人體代謝的生理作用，成為評(píng)價(jià)人體甲狀腺功能的重要檢測(cè)。
　　 平衡透析法是準(zhǔn)確測(cè)定人血清中FT4和FT3的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于其技術(shù)要求較高而且操作相當(dāng)費(fèi)時(shí)（通常需要16-24小時(shí)），因而限制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛使用。標(biāo)記免疫學(xué)的迅猛發(fā)展使得FT4和FT3的快速準(zhǔn)確測(cè)定成為可能，現(xiàn)今已經(jīng)出現(xiàn)了如放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemilinescent Immunoassay，CLI

3、A)、時(shí)間分辨熒光免疫分析(Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)及電化學(xué)發(fā)光(ElectricalChemilinescent Immunoassay，ECLIA)等這些方法學(xué)的FT4/FT3檢測(cè)試劑。將這些方法學(xué)進(jìn)一步分類，可將FT4的檢測(cè)試劑分為三類:兩步法、一步類似物法和標(biāo)記抗體法。兩步法盡管測(cè)值準(zhǔn)確性較高，但操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng);一步類似物法操作簡(jiǎn)便，精密度好，但準(zhǔn)確性一直備受質(zhì)疑;標(biāo)記抗體法

4、是目前許多商業(yè)化試劑公司普遍采用的方法，它綜合了兩步法和一步類似物法各自的優(yōu)點(diǎn)，因此被越來(lái)越廣泛的運(yùn)用。實(shí)際上，無(wú)論采用哪種方法，其中的關(guān)鍵難點(diǎn)在于測(cè)定的過(guò)程中盡量最少程度的破壞T4或T3與結(jié)合蛋白之間的平衡。
　　 時(shí)間分辨熒光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種高靈敏的定量免疫檢測(cè)技術(shù)，其獨(dú)特的地方在于用鑭系稀土離子作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，因鑭系稀土離子具有獨(dú)特的熒

5、光特性，該技術(shù)能夠獲得極高的信噪比，從而具有很高的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)。
　　 本論文采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法對(duì)人血清中的FT4與FT3檢測(cè)進(jìn)行了深入廣泛的研究。我們采用標(biāo)記抗體法建立了一套快速、靈敏、可靠的FT4/FT3時(shí)間分辨熒光免疫分析方法。
　　 本論文分為四個(gè)部分，分別為綜述、五種甲狀腺激素

6、衍生物的合成以及偶聯(lián)物的制備、血清FT4的TRFIA研究、血清FT3的TRFIA研究。
　　 論文的綜述部分詳細(xì)介紹了時(shí)間分辨熒光免疫分析法的方法學(xué)特點(diǎn)和FT4/FT3檢測(cè)方法的進(jìn)展情況;
　　 論文的第二部分詳細(xì)描述了五種甲狀腺激素衍生物的合成以及偶聯(lián)物的制備情況，旨在為論文的第三、四部分的方法學(xué)研究提供重要的原料基礎(chǔ);
　　 論文的第三部分與第四部分以Eu3+為標(biāo)記物分別對(duì)血清FT4和FT3的TRFIA進(jìn)行了

7、研究，我們首先通過(guò)比較不同的偶聯(lián)物產(chǎn)生的靈敏度高低差異來(lái)選取靈敏度最高的確定為最佳的偶聯(lián)物，然后用此最佳偶聯(lián)物來(lái)建立FT4/FT3的TRFIA，并進(jìn)行了詳細(xì)的性能評(píng)價(jià)和鑒定。
　　 方法:
　　 （一）采用化學(xué)合成的方法合成了五種甲狀腺激素衍生物并分別將其與兔IgG偶聯(lián)制備了其相應(yīng)的兔IgG偶聯(lián)物。
　　 1.以辛二酸作為起始原料，在DCC和NHS的作用下反應(yīng)得到辛二酸的雙NHS酯結(jié)構(gòu);
　　 2.以T4

8、、T3作為合成起始原料在HCL的甲醇溶液中反應(yīng)分別得到T4甲酯和T3甲酯;
　　 3.以T4、T3、T4甲酯、T3甲酯和T2作為合成起始原料與辛二酸的NHS酯以摩爾比為1∶2.1反應(yīng)形成各自的衍生物的單NHS酯結(jié)構(gòu);
　　 4.將五種衍生物的單NHS酯與兔IgG以摩爾比100∶1的比例進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)于室溫下攪拌20h后用分子篩進(jìn)行純化，并用BCA法分別測(cè)定這五種偶聯(lián)物濃度。
　　 （二）血清FT4時(shí)間分辨熒光

9、免疫分析法的建立
　　 1.利用活性炭、高嶺土制備去激素人血清作為校準(zhǔn)品配制用基質(zhì)。
　　 2.采用T4抗原配制FT4校準(zhǔn)品，并用商業(yè)化的DELFIA FT4 assay進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定后的校準(zhǔn)品濃度依次為:0 pmol/L，2.5 pmol/L，6.6 pmol/L，15 pmol/L，42 pmol/L，120 pmol/L。
　　 3.Eu3+標(biāo)記抗T4單克隆抗體的制備:抗體經(jīng)預(yù)處理后和標(biāo)記試劑DTTA-Eu

10、3+充分混勻，置于室溫過(guò)夜，次日上樣過(guò)分子篩純化。收集純化后的目的產(chǎn)物，經(jīng)0.22μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)標(biāo)記抗體的濃度進(jìn)行定量，最后加入銪標(biāo)穩(wěn)定液至終濃度為0.2％。
　　 4.96孔包被反應(yīng)板的制備:將已知濃度的偶聯(lián)物用包被液稀釋成某一終濃度，每孔加入150μl，37℃恒溫箱中靜置20小時(shí)。洗板3次后拍干，加入封閉液280μl/孔，4℃靜置12h。直接倒去封閉液，拍干。
　　 5.TRFIA標(biāo)記抗

11、體法檢測(cè)FT4每孔加入25μl血清樣本或校準(zhǔn)品，將標(biāo)記抗體用分析緩沖液以一定比例稀釋，每孔加入稀釋后的標(biāo)記抗體150μl。37℃振蕩孵育1h，洗滌6次，拍干，加150μl增強(qiáng)液，室溫慢速振蕩孵育5分鐘。然后在PerkinElmer1235分析儀上測(cè)定熒光值。
　　 6.最佳的偶聯(lián)物的確定分別包被T4-IgG、T4甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物，其包被終濃度均為2μg/ml，進(jìn)行FT4的TRFIA分析，得到FT4的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

12、依據(jù)ED50和Bmax來(lái)選取最佳偶聯(lián)物。
　　 7.系統(tǒng)優(yōu)化:對(duì)最佳包被量、標(biāo)記抗體的最佳稀釋度以及最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行確定。
　　 8.自制的TRFIA FT4檢測(cè)方法的性能評(píng)估
　　 8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析靈敏度的確定以X=Ln（濃度），Y=Logit(B/Bmax)=Ln((B/Bmax)/（1-B/Bmax）），以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性相關(guān)性。平行測(cè)定十次校準(zhǔn)品A的熒光值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，用A點(diǎn)熒光值的平均

13、值減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差得到的熒光值，依據(jù)PerkinElmer1235分析儀自帶的軟件可計(jì)算出所對(duì)應(yīng)的濃度，此濃度即為分析靈敏度。
　　 8.2 精密度
　　 對(duì)低、中、高三個(gè)不同濃度的FT4樣本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)(CV)。
　　 8.3 特異性
　　 （一）計(jì)算加入的待測(cè)交叉反應(yīng)物質(zhì)T3，反T3及T2分別能達(dá)到50％抑制時(shí)的濃度;
　　 （二）總T4分析本身達(dá)到50％抑制時(shí)

14、T4的濃度。
　　 交叉反應(yīng)定義為:后者與前者的比值×100％。
　　 8.4 甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析將一定量的TBG、HSA和Prealbumin加至零點(diǎn)校準(zhǔn)品中。最終得到分別含有4個(gè)不同終濃度的TBG(20，40，60和100 mg/L)，HSA(20，40，60和100 g/L)and Prealbumin(100，200，300和500 mg/L)零點(diǎn)校準(zhǔn)品。比較未添加和添加相關(guān)蛋白的零點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品熒光值

15、的變化。
　　 8.5 游離脂肪酸的抗干擾分析將1.1ml不同濃度的水相油酸分別加至PerkinElmer DELFIA FT4試劑盒中的D點(diǎn)凍干校準(zhǔn)品中（該試劑盒標(biāo)示的濃度為15.2pmol/L），充分溶解，最終得到4個(gè)含有不同濃度（1，2，3和5mmol/L）的油酸的校準(zhǔn)品。以加入1.1ml純化水溶解的D點(diǎn)凍干校準(zhǔn)品的濃度作為對(duì)照（當(dāng)作100％），比較添加油酸后的校準(zhǔn)品測(cè)定的FT4的濃度值變化。
　　 8.6 與進(jìn)口

16、試劑的相關(guān)性比較用進(jìn)口PerkinElmer DELFIA FT4試劑盒作為對(duì)照方法以評(píng)價(jià)我們建立的FT4的TRFIA的有效性。110份血清樣本同時(shí)用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)。
　　 （三）血清FT3時(shí)間分辨熒光免疫分析法的建立
　　 1.利用活性炭、高嶺土制備去激素人血清作為校準(zhǔn)品配制用基質(zhì)。
　　 2.采用T3抗原配制FT3校準(zhǔn)品，并用商業(yè)化的DELFIA FT3 assay進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定后的校準(zhǔn)品濃

17、度依次為:0 pmol/L，2.0 pmol/L，4.0 pmol/L，8.0 pmol/L，16 pmol/L，32 pmol/L。
　　 3.Eu3+標(biāo)記抗T3多克隆抗體的制備:抗體經(jīng)預(yù)處理后和標(biāo)記試劑DTTA-Eu3+充分混勻，置于室溫過(guò)夜，次日上樣過(guò)分子篩純化。收集純化后的目的產(chǎn)物，經(jīng)0.22μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)標(biāo)記抗體的濃度進(jìn)行定量，最后加入銪標(biāo)穩(wěn)定液至終濃度為0.2％。
　　 4.96

18、孔包被反應(yīng)板的制備:將已知濃度的偶聯(lián)物用包被液稀釋成某一終濃度，每孔加入150μl，37℃恒溫箱中靜置20小時(shí)。洗板3次后拍干，加入封閉液280μl/孔，4℃靜置12h。直接倒去封閉液，拍干。
　　 5.TRFIA標(biāo)記抗體法檢測(cè)FT3每孔加入25μl血清樣本或校準(zhǔn)品，將標(biāo)記抗體用分析緩沖液以一定比例稀釋，每孔加入稀釋后的標(biāo)記抗體150μl。37℃振蕩孵育1h，洗滌6次，拍干，加150μl增強(qiáng)液，室溫慢速振蕩孵育5分鐘。然后在Pe

19、rkinElmer1235分析儀上測(cè)定熒光值。
　　 6.最佳的偶聯(lián)物的確定分別包被T2-IgG、T3甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物，其終濃度均為2μg/ml，進(jìn)行FT3的TRFIA分析，得到FT3標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)ED50和Bmax來(lái)選取最佳偶聯(lián)物。
　　 7.系統(tǒng)優(yōu)化:對(duì)最佳包被量、標(biāo)記抗體的最佳稀釋度以及最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行確定。
　　 8.自制的TRFIA FT3檢測(cè)方法的性能評(píng)估
　　 8.1 標(biāo)

20、準(zhǔn)曲線和分析靈敏度的確定以X=Ln（濃度），Y=Logit(B/Bmax)=Ln((B/Bmax)/(1-B/Bmax）），以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性相關(guān)性。平行測(cè)定十次校準(zhǔn)品A的熒光值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，用A點(diǎn)熒光值的平均值減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差得到的熒光值，依據(jù)PerkinElmer1235分析儀自帶的軟件可計(jì)算出所對(duì)應(yīng)的濃度，此濃度即為分析靈敏度。
　　 8.2 精密度
　　 對(duì)低、中、高三個(gè)不同濃度的FT3樣本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定

21、10次，計(jì)算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)(CV)。
　　 8.3 特異性
　　 （一）計(jì)算加入的待測(cè)交叉反應(yīng)物質(zhì)T4，反T3及T2分別能達(dá)到50％抑制時(shí)的濃度;
　　 （二）總T3分析本身達(dá)到50％抑制時(shí)T3的濃度。
　　 交叉反應(yīng)定義為:后者與前者的比值×100％。
　　 8.4 甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析將一定量的TBG、HSA和Prealbumin加至零點(diǎn)校準(zhǔn)品中。最終得到分別含有4個(gè)不同

22、終濃度的TBG(20，40，60和100 mg/L)，HSA(20，40，60和100 g/L)and Prealbumin(100，200，300和500 mg/L)零點(diǎn)校準(zhǔn)品。比較未添加和添加相關(guān)蛋白的零點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品熒光值的變化。
　　 8.5 游離脂肪酸的抗干擾分析將1.1ml不同濃度的水相油酸分別加至PerkinElmer DELFIA FT3試劑盒中的D點(diǎn)凍干校準(zhǔn)品中（該試劑盒標(biāo)示的濃度為9.4pmol/L），充分溶解，最

23、終得到4個(gè)含有不同濃度（1，2，3和5mmol/L）的油酸的校準(zhǔn)品。以加入1.1ml純化水溶解的D點(diǎn)凍干校準(zhǔn)品的濃度作為對(duì)照（當(dāng)作100％），比較添加油酸后的校準(zhǔn)品測(cè)定的FT3的濃度值變化。
　　 8.6 與進(jìn)口試劑的相關(guān)性比較用進(jìn)口PerkinElmer DELFIA FT3試劑盒作為對(duì)照方法以評(píng)價(jià)我們建立的FT3的TRFIA的有效性。110份血清樣本同時(shí)用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　

24、 （一）五種甲狀腺激素的衍生物的合成和與兔IgG偶聯(lián)物的制備成功合成了五種甲狀腺激素的衍生物，并分別與兔IgG發(fā)生偶聯(lián)得到五種偶聯(lián)物T4-IgG、T3-IgG、T4甲酯-IgG、T3甲酯-IgG和T2-IgG。其濃度分別為:1.0mg/ml、1.1mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml和1.1mg/ml。
　　 （二）血清FT4時(shí)間分辨熒光免疫分析法的建立1.制備的Eu3+標(biāo)記抗T4單克隆抗體的濃度為130μg/ml;<

25、br>　　 2.通過(guò)比較T4-IgG、T4甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物產(chǎn)生的靈敏度高低，我們選取了T3-IgG作為最佳的包被偶聯(lián)物;
　　 3.對(duì)包被量、標(biāo)記抗體的稀釋度以及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化分析，得出:最佳的包被量為3μg/ml;標(biāo)記抗體的最佳稀釋度為1∶1000;最佳反應(yīng)時(shí)間為1h;
　　 4.FT4的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=-1.146X+1.324，相關(guān)性r=0.9997，計(jì)算得到的分析靈敏度為0.2pmol

26、/L;
　　 5.精密度
　　 分析內(nèi)變異系數(shù)為3.5-6.6％，分析間變異系數(shù)為和4.4-9.8％，精密度良好。
　　 6.特異性
　　 與T3的交叉反應(yīng)率為1.5％，與反T3的交叉反應(yīng)率為1.2％，與T2的交叉反應(yīng)率小于0.1％。
　　 7.甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析建立的FT4 TRFIA對(duì)于三種結(jié)合蛋白TBG、HSA以及Prealbumin的濃度變化不敏感，基本沒(méi)有干擾。
　

27、　 8.游離脂肪酸的抗干擾分析當(dāng)樣本中油酸的濃度為2mmol/L時(shí)，基本對(duì)本檢測(cè)方法不會(huì)有干擾，但當(dāng)樣本中油酸的濃度升至5mmol/L時(shí)，會(huì)使FT4的測(cè)值偏高15％左右。
　　 9.與PE進(jìn)口試劑的相關(guān)性比較兩種方法均檢測(cè)110例樣本，本研究方法與對(duì)照PE試劑盒相關(guān)性達(dá)到R2=0.984，能夠很好的滿足臨床檢測(cè)的要求。
　　 （三）血清FT3時(shí)間分辨熒光免疫分析法的建立
　　 1.制備的Eu3+標(biāo)記抗T3單克隆

28、抗體的濃度為150μg/ml;
　　 2.通過(guò)比較T2-IgG、T3甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物產(chǎn)生的靈敏度高低，我們選取了T2-IgG作為最佳的包被偶聯(lián)物;
　　 3.對(duì)包被量、標(biāo)記抗體的稀釋度以及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化分析，得出:最佳的包被量為2.5μg/ml;標(biāo)記抗體的最佳稀釋度為1∶800;最佳反應(yīng)時(shí)間為1h;
　　 4.FT3的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=-2.344X+1.980，相關(guān)性r=0.9998，計(jì)

29、算得到的分析靈敏度為0.3pmol/L;
　　 5.精密度
　　 分析內(nèi)變異系數(shù)為4.4-6.8％，分析間變異系數(shù)為4.8-9.6％，精密度良好。
　　 6.特異性
　　 與T4的交叉反應(yīng)率為0.2％，與反T3的交叉反應(yīng)率小于0.1％，與T2的交叉反應(yīng)率為0.4％。
　　 7.甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析建立的FT3 TRFIA對(duì)于三種結(jié)合蛋白TBG、HSA以及Prealbumin的濃度變化

30、不敏感，基本沒(méi)有干擾。
　　 8.游離脂肪酸的抗干擾分析當(dāng)樣本中油酸的濃度為2mmol/L時(shí)，基本對(duì)本檢測(cè)方法不會(huì)有干擾，但當(dāng)樣本中油酸的濃度升至5mmol/L時(shí)，會(huì)使FT3的測(cè)值偏高不到10％。
　　 9.與進(jìn)口試劑的相關(guān)性比較兩種方法均檢測(cè)110例樣本，本研究方法與對(duì)照PE試劑盒相關(guān)性達(dá)到R2=0.966，能夠很好的滿足臨床檢測(cè)的要求。
　　 結(jié)論:
　　 上述結(jié)果表明本論文建立的FT4和FT3時(shí)間分