羅格列酮對OLETF大鼠成纖維細胞生物學(xué)行為及晚期糖基化產(chǎn)物和Bcl-xL表達的影響.pdf

1、目的:
　　糖尿病皮膚病變嚴重危害人類健康，是糖尿病的重要并發(fā)癥之一。以往研究已經(jīng)證實，糖尿病皮膚在未遭受外源性損傷時已經(jīng)存在組織學(xué)和細胞生物學(xué)的改變--糖尿病“隱性損害”，例如糖尿病大鼠皮膚組織表皮和真皮變薄，表皮細胞層次欠清晰，部分表皮缺乏復(fù)層排列；真皮層部分膠原萎縮、腫脹，退化變性。
　　OLETF鼠是一種自發(fā)性2型糖尿病大鼠，本實驗以O(shè)LETF鼠作為2型糖尿病模型，以LETO鼠和攝入羅格列酮的OLETF鼠作為其對照，

2、通過觀察大鼠皮膚組織病理變化和成纖維細胞生物學(xué)行為的變化、測定晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)和Bcl-xL的表達水平，來探討羅格列酮對2型糖尿病大鼠皮膚組織的影響和特點。
　　方法:
　　大鼠在無特定病原體(SPF)級條件下單籠飼養(yǎng)，飼以標準飼料，12/12h光照黑暗循環(huán)，自由獲取食物和飲水。定期行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)監(jiān)測血糖，以血糖峰值>16.7mmol/L和負荷后120min血糖>11.1mmol/L診為糖尿病，只

3、具備上述1條為糖耐量減低。至30周時，共有成模OLETF大鼠12只，隨機分為糖尿病對照(DM)組、羅格列酮(RGZ)組(每組6只)，8只LETO鼠為正常對照(NC)組。RGZ組：羅格列酮以蒸餾水溶解稀釋，給藥劑量為3mg/kg·d。DM組與NC組以等量蒸餾水灌胃，各組均灌胃給藥12周，每日1次。
　　處死大鼠，取腹部皮膚組織，部分置于10％甲醛中，其余部分置于-70℃用于組織勻漿。其中用置于10%甲醛中的皮膚組織制備石蠟組織塊，制

4、成切片分別進行HE染色、天青-伊紅-瑞特氏染色、吖啶橙固定組織熒光染色、Masson三色染色和免疫組織化學(xué)染色來觀察大鼠皮膚表皮和真皮組織學(xué)變化、測定成纖維細胞和纖維細胞數(shù)量、觀察真皮組織細胞的凋亡程度、膠原纖維的變化和檢測AGEs和Bcl-xL。用置于-70℃的部分制成組織勻漿來測定膠原蛋白的含量。應(yīng)用多媒體分析軟件進行皮膚組織形態(tài)計量學(xué)分析，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠一般狀況比較：

5、OLETF大鼠較LETO肥胖、活動遲緩、懶動、精神萎頓、少動閉眼、弓背蜷縮、喜扎堆、畏寒喜暖、毛色干枯無光澤，皮膚明顯變薄，易激惹。
　　2.皮膚組織學(xué)變化的比較：NC組大鼠皮膚組織表皮與真皮結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，膠原纖維含量豐富，結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。與NC組相比，DM組大鼠表皮組織變薄，表皮細胞欠清晰，部分表皮缺乏復(fù)層排列；真皮層亦變薄，膠原纖維纖細、結(jié)構(gòu)不清晰，排列紊亂，部分膠原可見腫脹、變性。RGZ組大鼠皮膚表皮層較清晰，復(fù)層

6、排列接近對照組，真皮膠原豐富，表皮與真皮厚度明顯增加。
　　3.皮膚表皮和真皮厚度比較：與NC組[(28.18±4.64)μm]相比，DM組表皮厚度[(12.84±2.01)μm]降低(P<0.01)，RGZ組[(26.37±3.65)μm]表皮厚度無明顯變化(P>0.05)。與NC組[(1007.05±167.18)μm]相比，DM組真皮厚度[(591.32±66.77)μm]降低(P<0.01)，RGZ組[(957.60±10

7、6.34)μm]表皮厚度無明顯變化(P>0.05)。
　　4.成纖維細胞和纖維細胞數(shù)量比較：成纖維細胞胞核藍色，胞質(zhì)灰藍色；纖維細胞胞核深藍色，胞質(zhì)紅色。與NC組成纖維細胞數(shù)量(7.025±0.705)相比，DM組(3.75±0.597)和RGZ組(5.56±1.230)明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與NC組纖維細胞數(shù)量(3.4±0.668)相比，DM組(4.75±1.398)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0

8、.01)；而RGZ組(3.6±0.529)雖數(shù)量增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)
　　5.真皮組織凋亡細胞的分布：吖啶橙固定組織染色使正常細胞核DNA呈綠色或黃綠色均勻熒光，細胞質(zhì)和核仁的RNA為桔黃色或桔紅色熒光；而在凋亡細胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒。與NC組的真皮組織凋亡細胞陽性率[(4.0000±0.7560)%]相比，DM組[(9.6

9、667±0.8165)%]和RGZ組[(6.8333±0.7528)%]明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　6.膠原纖維變化的比較：NC組大鼠皮膚真皮中的膠原纖維豐富，結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊；而DM組膠原纖維數(shù)量減少，排列紊亂，變細、腫脹及變性，兩組有明顯差別。RGZ組膠原纖維較豐富，結(jié)構(gòu)不清晰，排列相對整齊，與DM組差別明顯，而與NC組相比，無明顯差別。
　　7.皮膚組織Bcl-xL表達變化：與NC組皮膚組織中

10、細胞Bcl-xL陽性表達的吸光度值(0.253±0.037)相比，DM組(0.119±0.034)明顯減少和RGE組(0.349±0.027)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　8.皮膚AGEs表達變化：DM組中AGEs陽性表達的吸光度值(0.362±0.070)高于NC組(0.128±0.032)，而RGZ組(0.228±0.051)低于DM組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　9.膠原蛋白含量的

11、比較：NC組大鼠每克皮膚中含266.0±54.8mg，明顯高于RGZ組(209.7±45.2mg/g)和DM組(149.9±18.4mg/g)。NC組與RGZ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DM組和RGZ組，NC組和DM組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(前者P<0.05，后者P<0.01)
　　結(jié)論:
　　1.OLETF模型大鼠明顯肥胖，皮膚明顯變薄，可作為研究2型糖尿病皮膚病變的理想動物模型。
　　2.糖尿病大鼠皮膚

12、組織結(jié)構(gòu)改變，表皮和真皮變薄，表皮細胞層次欠清晰，部分表皮缺乏復(fù)層排列，膠原纖維數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)不清晰，排列紊亂，變細、腫脹及變性，這可能與AGEs蓄積，造成細胞生存的內(nèi)環(huán)境紊亂，使細胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化有關(guān)。
　　3.糖尿病大鼠真皮組織凋亡細胞明顯增多，Bcl-xL表達減少，表明糖尿病可通過減少抗凋亡基因Bcl-xL來增加凋亡細胞數(shù)量。
　　4.糖尿病大鼠皮膚膠原蛋白含量減少，一是可能因為成纖維細胞凋亡增加引起的成纖維細胞