豬自體BMSCs促進真皮下血管網(wǎng)皮片成活的實驗研究.pdf

1、目的：通過建立真皮下毛細血管網(wǎng)皮片移植模型，建立骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)培養(yǎng)的方法，觀察自體骨髓間充質(zhì)干細胞促進真皮下毛細血管網(wǎng)皮片的存活影響。
　　方法：
　　1、豬BMSCs原代培養(yǎng)、傳代、純化。將小豬腹腔麻醉后，無菌抽取骨髓，通過梯度離心法分離，獲得骨髓間充質(zhì)干細胞，接種于含有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。3d后除去非貼壁細胞，觀察細胞形態(tài)及生長情況，待細胞鋪滿后進行傳代。取3代后的細胞備用。
　　2、BMSC

2、s的CM-DiI標記。取第三代BMSCs，進行DiI熒光標記，將標記后的BMSCs消化重懸，調(diào)節(jié)濃度備用。
　　3、真皮下毛細血管網(wǎng)皮片移植動物模型的建立。將小豬麻醉后，在背部兩側(cè)分別移植自體的真皮下毛細血管網(wǎng)皮片，一側(cè)注射鹽水，一側(cè)注射標記過DiI熒光的BMSCs。術(shù)后兩周觀察皮片中熒光細胞的表達、皮片存活的面積及病理變化。
　　結(jié)果：
　　1、MSC體外分離、培養(yǎng)、純化及形態(tài)觀察。倒置相差顯微鏡下觀察剛接種的骨髓中

3、體積較大的單核細胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中。48 h少數(shù)細胞呈成纖維細胞樣外形，以后細胞呈克隆樣生長。3～4 d開始迅速生長，待細胞達到單層匯合的80％～90%，細胞呈比較均一的梭形，成纖維樣細胞樣生長，形成旋渦狀。
　　2、 BMSCs的CM-DiI標記。CM-DiI熒光染料染色后細胞大部分著色，染色后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)后，保持良好的細胞形態(tài)。
　　3、真皮下毛細血管網(wǎng)皮片移植動物模型的建立。兩周后觀察到MSC組較鹽水組存活較好

4、，大部分存活，存活面積也較大。快速冰凍切片觀察，MSC組發(fā)現(xiàn)切片中具有大量紅色熒光細胞，注射點有更多熒光細胞聚集，血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)紅色熒光，皮片組織病理學觀察，MSC組血管增生明顯，數(shù)量較多，多于鹽水組。
　　結(jié)論：
　　1、密度梯度離心法和貼壁篩選法相結(jié)合來分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法較為簡單方便；
　　2、骨髓間充質(zhì)干細胞能夠提高真皮下毛細血管網(wǎng)皮片的存活面積；
　　3、骨髓間充質(zhì)干細胞能夠促進真皮下毛細血