幾種典型環(huán)境雌激素檢測(cè)的雙層類脂膜電化學(xué)免疫傳感技術(shù)研究.pdf

1、生物膜結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜,雙層類脂膜(BLMs)作為模擬生物膜模型已被廣泛接受。修飾了活性物質(zhì)的BLMs可作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)的通道,抗原-抗體鍵合的骨架,氧化還原反應(yīng)的雙極性電極或是能量轉(zhuǎn)化的器件,在研究各類生物分子與膜的相互作用,了解生物膜功能,開發(fā)新型生物傳感器方面發(fā)揮了重要作用。環(huán)境雌激素是一類存在于環(huán)境中,具有類似生物體內(nèi)雌激素活性的化學(xué)物質(zhì)。越來越多的證據(jù)顯示,許多被人類不合理釋放于環(huán)境中的化學(xué)污染物具有雌激素的生物效應(yīng)。建立準(zhǔn)確、靈敏

2、、高效的環(huán)境雌激素檢測(cè)篩查方法對(duì)把握環(huán)境質(zhì)量、預(yù)防環(huán)境雌激素對(duì)人類造成的危害具有重要意義,現(xiàn)有環(huán)境雌激素的檢測(cè)篩查技術(shù)尚需進(jìn)一步的補(bǔ)充完善。
　　本研究針對(duì)制約傳感器發(fā)展的固定化關(guān)鍵技術(shù),以17β-雌二醇,己烯雌酚,雙酚A等典型環(huán)境雌激素為代表,研究活性物質(zhì)(水溶性抗體和膜受體)在BLMs上的修飾,分別以雌激素抗體和膜受體(mER)作為功能元件,構(gòu)建基于BLMs的新型電化學(xué)免疫傳感器,并初步用于環(huán)境雌激素的檢測(cè)和篩查,主要研究?jī)?nèi)容

3、包括:
　　1.固體支撐穩(wěn)定BLMs體系的構(gòu)建
　　(1)成膜液組成和配比的優(yōu)化:卵磷脂和膽固醇作為成膜液主要成分,研究了不同卵磷脂和膽固醇濃度和配比對(duì)BLMs穩(wěn)定性的影響。
　　(2)不同支撐材料的選擇及成膜技術(shù)研究:膜片電極作為支撐材料,分別嘗試了直接沾取成膜,成膜后再次自組裝及脂質(zhì)體成膜等幾種不同的BLMs制備方法,考察了不同方法形成脂膜的性能。
　　(3)BLMs的穩(wěn)定性考察:瓊脂作為支撐材料,進(jìn)一步考察

4、了膜片電極和電化學(xué)鉑電極上瓊脂支撐BLMs的制備方法,構(gòu)建了瓊脂支撐穩(wěn)定的BLMs體系。
　　2.精氨酸多肽偶聯(lián)抗體制備技術(shù)研究
　　(1)適合偶聯(lián)修飾物的篩查及偶聯(lián)方法研究:實(shí)驗(yàn)篩選了氨基壬烷,8個(gè)精氨酸組成的細(xì)胞穿膜肽(R8)等抗體偶聯(lián)修飾物。以17β-雌二醇抗體為代表,采用碳化二亞胺法實(shí)現(xiàn)了R8與抗體的偶聯(lián)。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)最后選擇EDC與R8反應(yīng)的摩爾比為10:1,活化時(shí)間為20min,在優(yōu)化好的條件下,M

5、ALDI-TOF-MS分析結(jié)果表明R8與抗17β-雌二醇抗體偶聯(lián)比約為5:1。
　　(2)修飾前后抗體的活性鑒定:SPR技術(shù)考察了抗體修飾前后親和常數(shù)。17β-雌二醇抗體修飾前后的親和常數(shù)分別為3.8509×10-5和2.3233×10-6,親和能力略有增加,提示R8修飾不影響17β-雌二醇抗體的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合活性,可滿足下一步的測(cè)定要求。實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到相同摩爾濃度抗體修飾后與抗原結(jié)合引起SPR信號(hào)響應(yīng)增大,進(jìn)一步證實(shí)了R8對(duì)抗體

6、的修飾。
　　(3)修飾位點(diǎn)的初步研究:對(duì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行了初步研究。利用MALDI-TOF-MS技術(shù),采用trypin酶解方法對(duì)修飾前后的雌二醇抗體進(jìn)行了酶解,修飾R8后抗體在1496.8528Da,1624.9769Da,2013.2524Da處比較強(qiáng)的肽指紋峰消失,在低分子量(<600Da)范圍內(nèi)的肽指紋峰增加。實(shí)驗(yàn)合成了適用于MALDI-TOF-MS的新基質(zhì)[CHC-][NH3+-Si-SBA-15-Si-NH3+][CHC-

7、],去除了基質(zhì)信號(hào)的干擾,考察了低分子量范圍內(nèi)肽指紋峰的變化。
　　3.R8偶聯(lián)抗體修飾BLMs電化學(xué)免疫傳感技術(shù)研究
　　(1)抗體修飾BLMs的研制:優(yōu)化了卵磷脂和膽固醇的濃度,卵磷脂濃度為20％,與膽固醇的質(zhì)量比在4:1-4.5:1之間時(shí),形成的BLMs非常穩(wěn)定。采用兩步自組裝方法制備了17β-雌二醇修飾的BLMs,原子力掃描電鏡測(cè)試了空白成膜液和自組裝后成膜液的表面形態(tài),空白的成膜液AFM掃描結(jié)果非常光滑,在自組裝R

8、8修飾雌二醇抗體后,其AFM掃描結(jié)果可看到片片突起,修飾雌二醇抗體后相同電壓下BLMs的電流響應(yīng)值降低。實(shí)驗(yàn)對(duì)抗體的自組裝時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,選擇30分鐘的自組裝時(shí)間。
　　(2)17β-雌二醇抗體修飾BLMs傳感器構(gòu)建:以修飾了雌二醇抗體的BLMs作為識(shí)別元件,采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方法,利用線性掃描法考察了17β-雌二醇對(duì)該生物傳感體系的響應(yīng)。對(duì)17β-雌二醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物E2-BSA的濃度進(jìn)行了優(yōu)化,在檢測(cè)體系中加入150μL1mg/mLE

9、2-BSA時(shí)與抗體的結(jié)合基本達(dá)到飽和。傳感器對(duì)17β-雌二醇的響應(yīng)范圍為0.01-0.20ng/mL,最低檢出濃度0.01ng/mL,并初步應(yīng)用于自來水樣的測(cè)定。在優(yōu)化好的條件下,考察了體系的抗干擾性能,雙酚A,己烯雌酚,4-壬基酚等常見環(huán)境雌激素對(duì)本體系均無響應(yīng)。
　　(3)己烯雌酚抗體修飾BLMs傳感器構(gòu)建:在優(yōu)化好的條件下,利用R8對(duì)己烯雌酚抗體進(jìn)行修飾,制備了己烯雌酚抗體修飾的BLMs,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法測(cè)定了己烯雌酚對(duì)該生物傳感

10、體系的響應(yīng),建立的傳感器響應(yīng)體系對(duì)己烯雌酚的響應(yīng)范圍為0.10-0.20ng/mL,最低檢出濃度為0.10ng/mL,傳感器對(duì)雌二醇,雙酚A,4-壬基酚等常見環(huán)境雌激素顯示了良好的抗干擾性能,也進(jìn)一步驗(yàn)證了修飾方法和檢測(cè)體系的可行性。
　　4.mER修飾BLMs電化學(xué)免疫傳感技術(shù)研究
　　(1)mER修飾BLMs的構(gòu)建:利用生物膜上mER與卵磷脂和膽固醇組成成膜液良好的生物相容性實(shí)現(xiàn)mER與成膜液的融合,原子力掃描電鏡掃描觀

11、察到不同于空白成膜液的粗糙突起,進(jìn)一步證實(shí)了mER在成膜液中的存在。
　　(2)方法條件優(yōu)化:對(duì)成膜條件進(jìn)行了優(yōu)化,mER溶液與空白成膜液1:1混合時(shí)間為5min。修飾mER的BLMs穩(wěn)定性良好,在0-1.0V范圍內(nèi)的線性掃描結(jié)果表明:相同掃描電壓下與空白相比修飾了mER的BLMs膜電流略有增加,也進(jìn)一步證實(shí)了修飾物在BLMs上的鑲嵌。
　　(3)mER修飾BLMs對(duì)典型雌激素的響應(yīng):采用線性掃描伏安方法考察了mER修飾BL

12、Ms對(duì)典型雌激素雌二醇的響應(yīng),該體系對(duì)17β-雌二醇方法的檢出限為1×10-10mol/L,17β-雌二醇濃度大于1×10-8mol/L時(shí)結(jié)合基本達(dá)到飽和。該體系對(duì)濃度為1×10-5mol/L雙酚A可產(chǎn)生響應(yīng),1×10-10mol/L17β-雌二醇和1×10-5mol/L雙酚A同時(shí)作用時(shí)存在協(xié)同效應(yīng),傳感器的響應(yīng)增強(qiáng)。
　　本研究建立了水溶性抗體及膜受體兩種不同的BLMs表面活性物質(zhì)固定化方法,通過對(duì)成膜條件和修飾方法的摸索,建立