bFGF-雙層膠原基復(fù)合材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損及其相關(guān)研究.pdf

1、創(chuàng)傷修復(fù)過程是多種生長因子協(xié)調(diào)的時空控制過程。應(yīng)用外源性生長因子在組織修復(fù)過程中顯示了較好的應(yīng)用前景，但是實現(xiàn)生長因子的時空控制，進而實現(xiàn)創(chuàng)傷組織的再生修復(fù)，仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)。組織工程方法的出現(xiàn)，為解決組織修復(fù)提供了一個新的途徑。構(gòu)建具有時空控制釋放特點的載生長因子組織工程支架已成為一個新的研究方向。時空控制釋放生長因子體現(xiàn)了生長因子釋放的兩個特點：1．所釋放的生長因子聚集與創(chuàng)傷組織局部，作用于相應(yīng)的靶組織和細胞，并避免釋放于周圍組

2、織引起的不可預(yù)期結(jié)果；2．生長因子釋放應(yīng)該持續(xù)足夠長的時間，滿足組織再生修復(fù)的需求。
　　 生長因子的釋放與支架材料的結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性。通過調(diào)整支架材料的疏松或致密結(jié)構(gòu)，可以改變所負載生長因子的釋放行為。據(jù)此，本研究設(shè)計制備一種具有雙側(cè)疏松或致密程度不同的雙層結(jié)構(gòu)材料，以期通過材料的結(jié)構(gòu)差異調(diào)整生長因子的釋放行為，實現(xiàn)所負載生長因子的時空控制釋放。并將所制備材料應(yīng)用于傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下鉆孔術(shù)、微骨折、自體骨軟骨鑲嵌成型術(shù)

3、和自體軟骨細胞移植術(shù)等難以實現(xiàn)有效修復(fù)的的創(chuàng)傷軟骨組織。
　　 1．研究中選用膠原材料為主要原材料構(gòu)建組織工程支架。由于堿性成纖維細胞生長因子(basicFibroblastGrowthFactor，bFGF）是體內(nèi)最有效的有絲分裂原之一,對軟骨細胞、間充質(zhì)干細胞有顯著的促有絲分裂作用。此外，bFGF還具有促進未分化間充質(zhì)細胞向軟骨細胞方向分化、促血管增生作用。因此，選用bFGF為模型生長因子。研究中將載有bFGF的納米顆粒負載

4、于雙側(cè)致密程度不同的膠原膜材料之間，進而獲得復(fù)合支架材料。并對材料進行體外釋放行為、體外細胞培養(yǎng)以及關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的研究。具體研究內(nèi)容包括：制備一種復(fù)合負載bFGF的殼聚糖-肝素(CS-Hep)納米粒子的雙層膠原基復(fù)合材料，雙層膠原膜分別采用冷凍干燥法和風(fēng)干法制備，分別命名為CFM和CAM，對其進行掃描電鏡和紅外表征；采用流池法，考察復(fù)合材料在PBS和膠原酶溶液兩種不同釋放介質(zhì)中對模型蛋白HSA的釋放行為，同時應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察異硫

5、氰酸熒光素(FITC)標記的HSA在PBS溶液中的釋放情況。
　　 2．體外培養(yǎng)L-929細胞，分別接種于復(fù)合bFGF雙層膠原基復(fù)合材料(bDM)和未復(fù)合bFGF雙層膠原基復(fù)合材料(DM)以及交聯(lián)的凍干膠原膜(CFM)表面，用四甲基偶氮唑鹽微量反應(yīng)比色法(MTT)法、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在第3、5天的粘附和增殖的情況。
　　 3．制備bFGF/雙層膠原基復(fù)合材料浸提液，進行急性全身毒性試驗、溶血試驗、熱原試驗和細胞毒

6、性試驗，對材料進行生物安全性評價。
　　 4.選取60只家兔，隨機分成5組bDM-CFM（bDM材料CFM朝向軟骨下骨面）組、bDM-CAM（bDM材料CAM朝向軟骨下骨面）組、DM-CFM（DM材料CFM朝向軟骨下骨面）組、DM-CAM（DM材料CAM朝向軟骨下骨面）組、假手術(shù)對照（單純?nèi)睋p不加干預(yù)）組。于兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)構(gòu)建軟骨缺損模型，將材料分別按CFM和CAM層朝向軟骨下骨面植入缺損處，術(shù)后1、2、4、8、12、16周采集標

7、本，通過大體觀察、組織學(xué)評分、免疫組化檢測Ⅱ型膠原，分析不同處理組軟骨修復(fù)的情況。并在上述實驗的同時，于第3d、1w、2w、4w、8w分別抽取關(guān)節(jié)液，用抗體芯片檢測20種相關(guān)生長因子、細胞因子及炎性趨化因子的時間變化情況。
　　 實驗結(jié)果表明，bFGF/雙層膠原基復(fù)合材料兩側(cè)疏松程度差異明顯。在體外釋放實驗中，釋放液為PBS時，CAM→CFM釋放百分率高；而在膠原酶釋放液中，CFM→CAM組釋放百分率高，F(xiàn)ITC標記的HSA釋放

8、實驗顯示雙層材料對于蛋白分子具有不均一的釋放特點。這些結(jié)果提示，所構(gòu)建的支架材料對生長因子具有時空控制性釋放特點。
　　 在體外細胞培養(yǎng)實驗中，所有材料均顯示良好的細胞粘附和促增殖作用，同時包載bFGF組細胞增殖率較相應(yīng)未包載bFGF組更高(P＜0.05)。包載bFGF材料由于結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致bDM-CFM層更有利于細胞粘附和增殖(P＜0.05），這可能與bDM-CFM對生長因子有時空控制釋放特性有關(guān)；激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果也證

9、實了這一觀點。
　　 生物學(xué)評價研究發(fā)現(xiàn)，bFGF/雙層膠原基復(fù)合材料浸提液pH值為6.55±0.13，接近中性；急性全身毒性試驗、熱原試驗、溶血試驗均為陰性,細胞毒性為0級，說明本材料具有良好的生物安全性，對機體無毒，對細胞有較強的親和作用。
　　 關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過程中，對不同時期關(guān)節(jié)液中生長因子、細胞因子及炎性趨化因子進行抗體芯片檢測，結(jié)果表明因材料結(jié)構(gòu)不同而引起的生長因子釋放不同可導(dǎo)致被檢因子表現(xiàn)出不同的時間變化過程