生長因子誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中的mRNA-microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò).pdf

1、背景和目的:
　　 腫瘤患者死因的90％可歸因于腫瘤轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞的侵襲-轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的多步驟過程。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是哺乳動物胚胎發(fā)育過程中必需經(jīng)歷的生理過程，它與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系近年來成為腫瘤轉(zhuǎn)移領(lǐng)域最大的突破。EMT過程中，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)，極性消失，具有較強的遷移、運動能力，獲得了間質(zhì)細(xì)胞的表型。
　　 EMT與腫瘤侵

2、襲-轉(zhuǎn)移的關(guān)系在絕大多數(shù)實體腫瘤中得到明確，為腫瘤轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域帶來巨大的變革和機會。研究人員可以利用細(xì)胞模型來模擬EMT過程（特別是生長因子誘導(dǎo)的EMT），便捷地研究EMT過程中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 鼻咽癌是華南地區(qū)常見的惡性腫瘤，其中95％以上的鼻咽癌屬于低分化癌，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移幾率大。通過生長因子（如EGF或TGF-β1）誘導(dǎo)構(gòu)建鼻咽癌細(xì)胞的EMT模型，分析EMT過程中mRNA表達(dá)譜和microRNA表達(dá)譜的變化規(guī)律，將有助于理

3、解EMT過程中的分子調(diào)控機制，篩選和侵襲-轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志物，對于鼻咽癌的轉(zhuǎn)移研究具有較重要的基礎(chǔ)與臨床意義。
　　 方法:
　　 利用EGF（終濃度50 ng/ml）或TGF-β1（終濃度10 ng/ml）處理鼻咽癌細(xì)胞HK-136小時，誘導(dǎo)EMT發(fā)生。分離細(xì)胞RNA，利用基因芯片分別進(jìn)行mRNA和mi croRNA表達(dá)譜分析。
　　 對mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行pathway分析、GO分析、GSEA（基因集富集分析

4、），并分析了EMT過程中EGFR、TGF-β和EMT通路的變化情況。將EGF或TGF-β1調(diào)控基因所構(gòu)成的“特征”與鼻咽癌組織樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。
　　 對microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，對差異表達(dá)的microRNA分子做了初步的功能分析，并預(yù)測其潛在的靶基因。
　　 結(jié)合差異microRNA和mRNA分子，利用microRNA-靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，建立EMT過程中的“microRNA-靶基因-信

5、號通路”網(wǎng)絡(luò)。
　　 結(jié)果:
　　 利用EGF或TGF-β1誘導(dǎo)36小時之后，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞HK-1出現(xiàn)了明顯的EMT，對細(xì)胞的mRNA和microRNA表達(dá)譜產(chǎn)生明顯的影響。EGF誘導(dǎo)的EMT過程中，383個基因表達(dá)上調(diào)，161個下調(diào);8個microRNA上調(diào)，4個下調(diào)。TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中，124個基因上調(diào)，165個下調(diào);12個microRNA上調(diào)，28個下調(diào)。
　　 EGF和TGF-β1處理組中共

6、同上調(diào)的基因多與細(xì)胞運動能力相關(guān)，共同下調(diào)的基因多與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂相關(guān)。差異基因所涉及的信號通路主要是:Jak-STAT信號通路、細(xì)胞因子-受體交互作用、Focal adhesion、TGF-β信號通路、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)受體交互作用、ErbB信號通路等。
　　 GSEA分析發(fā)現(xiàn)EGF所引起的細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)與炎癥、感染所引起的應(yīng)激反應(yīng)具有很大相似性，而TGF-β1主要影響了Tp53和Tp63的靶基因集。另外，EGF主要影響了轉(zhuǎn)

7、錄因子IRF、STAT5、HMGIY、BACH2、HNF4A和E47的靶基因集，而TGF-β1主要影響了轉(zhuǎn)錄因子ATF3、SP1、TCF11、AML和AP1的靶基因集。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，EGF誘導(dǎo)的EMT過程中，主要依賴ETS家族-EGR1調(diào)控軸線;而TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中，主要依賴SMAD轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。
　　 將EGF或TGF-β1調(diào)控基因所構(gòu)成的“特征”與鼻咽癌組織樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)“EGF特

8、征”對于鼻咽癌發(fā)病機制具有促進(jìn)作用，而“TGF-β特征”對鼻咽癌發(fā)病機制不具有促進(jìn)作用。
　　 通過對差異表達(dá)microRNA分子的上游DNA序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合強度進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)生長因子誘導(dǎo)的EMT過程中，mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系和microRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系存在明顯的差異。
　　 結(jié)合miRNA芯片和mRNA芯片結(jié)果，首次報道了EMT過程中的“microRNA-靶基因-信號通路”網(wǎng)絡(luò)。
　　 生長因子誘導(dǎo)的

9、鼻咽癌細(xì)胞EMT過程中，miR-505和miR-1207-5p表達(dá)上調(diào);初步的功能分析顯示它們具有抑癌基因的特征。miR-505和miR-1207-5p的這種負(fù)反饋作用可能是EMT過程中魯棒性的機制之一。
　　 結(jié)論:
　　 1.EGF和TGF-β1均可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT，對細(xì)胞的mRNA和microRNA表達(dá)譜產(chǎn)生明顯的影響。
　　 2.EGF誘導(dǎo)的EMT過程中，主要依賴ETS家族-EGR1調(diào)控軸線;而T