HLA-G穩(wěn)定表達的人胚胎干細胞分化細胞的免疫耐受性研究.pdf

1、人胚胎干細胞(Human embryonic stem cells，hESCs)具有自我復制及多潛能分化的能力，在體外適宜培養(yǎng)條件下可定向分化成特定的終末細胞，因此，胚胎干細胞最終可用于細胞移植治療替代器官移植。目前，有關(guān)人胚胎干細胞定向誘導分化的方法已成熟有效，在體外可將胚胎干細胞定向誘導分化為神經(jīng)元、心肌細胞、上皮細胞、造血前體細胞、角化細胞、成骨細胞及肝細胞等。相對日趨匱乏的移植器官，胚胎干細胞在體外可以無限增殖，提供源源不斷的供

2、體細胞，因此人胚胎干細胞有望成為細胞移植治療的理想“種子細胞”。然而，無論是器官移植還是細胞移植治療，免疫排斥反應是臨床需要解決的首要問題，同樣也是人胚胎干細胞用于臨床治療組織器官退行型病變需要考慮的問題。為了避免移植物與宿主之間的免疫排斥反應，再生醫(yī)學的一個攻克目標是建立與宿主同基因的細胞。而獲得這種細胞可以通過下述途徑：在成體細胞上進行核移植建立多能干細胞，或通過轉(zhuǎn)錄因子對成體細胞重編程成為多潛能細胞，或?qū)ε咛ジ杉毎M行基因修飾。針

3、對不同患者的特異性，最理想的治療方案是設計一株能夠逃逸機體免疫系統(tǒng)監(jiān)控的萬能細胞。
　　 人類白細胞抗原G(Human Leucocyte Antigen G，HLA-G)屬于非經(jīng)典的MHCⅠ類分子，和其他的MHCⅠ類蛋白一樣是由膜結(jié)合的重鏈與九聚肽以非共價鍵組成的復合物。不同與經(jīng)典的MHCⅠ類分子，HLA-G呈現(xiàn)出低多態(tài)性和局限性分布的特點。HLA-G最早是從妊娠胎盤組織中克隆而來，主要表達在胎盤滋養(yǎng)細胞、蛻膜細胞。HLA-G

4、這種特殊的局限性組織分布特性提示其可能與妊娠期間母胎免疫耐受作用有關(guān)。目前，許多學者已公認HLA-G在母胎免疫耐受、器官移植耐受及腫瘤免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用?；谝陨咸岢龅挠^點，本課題設計將HLA-G1穩(wěn)定表達在人胚胎干細胞，驗證穩(wěn)定表達HLA-G1的人胚胎干細胞具有生物學功能，并提出穩(wěn)定表達HLA-G1的人胚胎干細胞及其誘導分化細胞在移植過程具有免疫耐受功能這一假說。本課題就以上提出的觀點，為解決細胞移植可能出現(xiàn)的移植物與受體之間

5、出現(xiàn)的免疫排斥進行了如下嘗試：
　　 以慢病毒整合到宿主基因組的方法，將外源性基因HLA-G1表達在人胚胎干細胞中，富集穩(wěn)定表達HLA-G1的人胚胎干細胞。HLA-G1+hES細胞在形態(tài)上與正常hES細胞無明顯差別均呈克隆性生長，HLA-G1與正常hES細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2共同表達于HLA-G1+hES細胞上。通過體內(nèi)SCID小鼠成瘤實驗，發(fā)現(xiàn)HLA-G1+hES能夠形成包含三胚層的畸胎瘤，其出瘤時間、成瘤效率

6、和瘤重與正常的hES細胞相比無差別(P>0.05)。實驗初步表明HLA-G1并不影響hES細胞的多能性，致瘤性與普通hES細胞相似，隨著hES細胞的分化，HLA-G1仍然能夠持續(xù)表達。
　　 以間質(zhì)細胞衍生的誘導功能(stromal-derived inducing activity，SDIC)法替代經(jīng)典的擬胚胎誘導法將hES細胞在體外定向誘導分化為神經(jīng)外胚層多巴胺能神經(jīng)元(Dopaminergic，DA)細胞。參考已發(fā)表文獻中

7、SDIC誘導分化法并將其進行改進，即：自誘導分化中期開始加入促分化因子SHH、FGF-8，改良后的SDIC共培養(yǎng)法可提高hES細胞的分化效率，分化10-12天即可檢測出表達酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性的多巴胺能神經(jīng)元細胞。用高效液相色譜分析法檢測HLA-G1+hES細胞誘導分化的DA神經(jīng)元，在經(jīng)K+去極化后可分泌多種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，具有生物活性。ELISA法同樣檢測出在經(jīng)K+去極化后的培養(yǎng)上清液

8、中含有多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)。同時還追蹤HLA-G1+hES細胞在不同分化時期均持續(xù)表達HLA-G1。
　　 分別將HLA-G1+hES細胞、免疫共沉淀法富集得到的HLA-G1純化蛋白、HLA-G1+hES誘導分化DA神經(jīng)元細胞與T淋巴細胞反應，觀察到上述三種HLA-G1表現(xiàn)形式均可明顯抑制T淋巴細胞增殖。由于機體存在血-腦屏障，外周血T淋巴細胞難以通過血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮吞噬、清除異物的免疫作用。本

9、實驗將HLA-G1+hES細胞誘導分化DA神經(jīng)元細胞與小膠質(zhì)細胞(BV2)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HLA-G1不僅能夠抑制BV2細胞的增殖，還能顯著抑制BV2細胞分泌IL-1β、IFN-γ炎性因子。
　　 用人晶芯片高通量篩查HLA-G1+hES細胞基因表達情況，結(jié)果顯示HLA-G1可差異性調(diào)節(jié)425個基因(比率>2.0或<0.5)，上調(diào)203個基因、降調(diào)222個基因。在所有差異性調(diào)節(jié)的基因中，參與分子粘附途徑、腫瘤生長因子-β信號途徑及免

10、疫應答的基因占主導。HLA-G1可差異性調(diào)節(jié)7種免疫相關(guān)基因，正是這種協(xié)同效應能夠解釋HLA-G1+hES細胞具有免疫抑制效應。
　　 本課題以慢病毒整合到宿主基因組的方法對hES細胞進行基因修飾，將外源基因HLA-G1表達在hES細胞中，得到一株穩(wěn)定表達HLA-G1的人胚胎干細胞。HLA-G1+hES細胞在形態(tài)上與正常hES細胞無明顯差別均呈克隆性生長，HLA-G1能夠與正常hES細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2共同表達

11、于HLA-G1+hES細胞上，而且通過體內(nèi)SCID小鼠成瘤實驗，發(fā)現(xiàn)HLA-G1+hES能夠形成包含三胚層的畸胎瘤。實驗初步表明HLA-G1不影響hES細胞的多能性，隨著hES細胞的分化，HLA-G1仍然能夠持續(xù)表達。穩(wěn)定表達HLA-G1的hES及由此來源的分化終末細胞均具有免疫抑制作用，HLA-G1以三種不同的表現(xiàn)形式，在體外均可抑制T細胞的增殖，減少小膠質(zhì)細胞釋放炎性因子IL-1β、IFN-γ。無論是HLA-G1+hES還是由此分化