HLA-G穩(wěn)定表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞分化細(xì)胞的免疫耐受性研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(Human embryonic stem cells，hESCs)具有自我復(fù)制及多潛能分化的能力，在體外適宜培養(yǎng)條件下可定向分化成特定的終末細(xì)胞，因此，胚胎干細(xì)胞最終可用于細(xì)胞移植治療替代器官移植。目前，有關(guān)人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法已成熟有效，在體外可將胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、角化細(xì)胞、成骨細(xì)胞及肝細(xì)胞等。相對(duì)日趨匱乏的移植器官，胚胎干細(xì)胞在體外可以無(wú)限增殖，提供源源不斷的供

2、體細(xì)胞，因此人胚胎干細(xì)胞有望成為細(xì)胞移植治療的理想“種子細(xì)胞”。然而，無(wú)論是器官移植還是細(xì)胞移植治療，免疫排斥反應(yīng)是臨床需要解決的首要問(wèn)題，同樣也是人胚胎干細(xì)胞用于臨床治療組織器官退行型病變需要考慮的問(wèn)題。為了避免移植物與宿主之間的免疫排斥反應(yīng)，再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)攻克目標(biāo)是建立與宿主同基因的細(xì)胞。而獲得這種細(xì)胞可以通過(guò)下述途徑：在成體細(xì)胞上進(jìn)行核移植建立多能干細(xì)胞，或通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)成體細(xì)胞重編程成為多潛能細(xì)胞，或?qū)ε咛ジ杉?xì)胞進(jìn)行基因修飾。針

3、對(duì)不同患者的特異性，最理想的治療方案是設(shè)計(jì)一株能夠逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)控的萬(wàn)能細(xì)胞。
　　 人類(lèi)白細(xì)胞抗原G(Human Leucocyte Antigen G，HLA-G)屬于非經(jīng)典的MHCⅠ類(lèi)分子，和其他的MHCⅠ類(lèi)蛋白一樣是由膜結(jié)合的重鏈與九聚肽以非共價(jià)鍵組成的復(fù)合物。不同與經(jīng)典的MHCⅠ類(lèi)分子，HLA-G呈現(xiàn)出低多態(tài)性和局限性分布的特點(diǎn)。HLA-G最早是從妊娠胎盤(pán)組織中克隆而來(lái)，主要表達(dá)在胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞。HLA-G

4、這種特殊的局限性組織分布特性提示其可能與妊娠期間母胎免疫耐受作用有關(guān)。目前，許多學(xué)者已公認(rèn)HLA-G在母胎免疫耐受、器官移植耐受及腫瘤免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用?；谝陨咸岢龅挠^點(diǎn)，本課題設(shè)計(jì)將HLA-G1穩(wěn)定表達(dá)在人胚胎干細(xì)胞，驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)HLA-G1的人胚胎干細(xì)胞具有生物學(xué)功能，并提出穩(wěn)定表達(dá)HLA-G1的人胚胎干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化細(xì)胞在移植過(guò)程具有免疫耐受功能這一假說(shuō)。本課題就以上提出的觀點(diǎn)，為解決細(xì)胞移植可能出現(xiàn)的移植物與受體之間

5、出現(xiàn)的免疫排斥進(jìn)行了如下嘗試：
　　 以慢病毒整合到宿主基因組的方法，將外源性基因HLA-G1表達(dá)在人胚胎干細(xì)胞中，富集穩(wěn)定表達(dá)HLA-G1的人胚胎干細(xì)胞。HLA-G1+hES細(xì)胞在形態(tài)上與正常hES細(xì)胞無(wú)明顯差別均呈克隆性生長(zhǎng)，HLA-G1與正常hES細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2共同表達(dá)于HLA-G1+hES細(xì)胞上。通過(guò)體內(nèi)SCID小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HLA-G1+hES能夠形成包含三胚層的畸胎瘤，其出瘤時(shí)間、成瘤效率

6、和瘤重與正常的hES細(xì)胞相比無(wú)差別(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)初步表明HLA-G1并不影響hES細(xì)胞的多能性，致瘤性與普通hES細(xì)胞相似，隨著hES細(xì)胞的分化，HLA-G1仍然能夠持續(xù)表達(dá)。
　　 以間質(zhì)細(xì)胞衍生的誘導(dǎo)功能(stromal-derived inducing activity，SDIC)法替代經(jīng)典的擬胚胎誘導(dǎo)法將hES細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)外胚層多巴胺能神經(jīng)元(Dopaminergic，DA)細(xì)胞。參考已發(fā)表文獻(xiàn)中

7、SDIC誘導(dǎo)分化法并將其進(jìn)行改進(jìn)，即：自誘導(dǎo)分化中期開(kāi)始加入促分化因子SHH、FGF-8，改良后的SDIC共培養(yǎng)法可提高h(yuǎn)ES細(xì)胞的分化效率，分化10-12天即可檢測(cè)出表達(dá)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽(yáng)性的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。用高效液相色譜分析法檢測(cè)HLA-G1+hES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的DA神經(jīng)元，在經(jīng)K+去極化后可分泌多種兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，具有生物活性。ELISA法同樣檢測(cè)出在經(jīng)K+去極化后的培養(yǎng)上清液

8、中含有多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)。同時(shí)還追蹤HLA-G1+hES細(xì)胞在不同分化時(shí)期均持續(xù)表達(dá)HLA-G1。
　　 分別將HLA-G1+hES細(xì)胞、免疫共沉淀法富集得到的HLA-G1純化蛋白、HLA-G1+hES誘導(dǎo)分化DA神經(jīng)元細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，觀察到上述三種HLA-G1表現(xiàn)形式均可明顯抑制T淋巴細(xì)胞增殖。由于機(jī)體存在血-腦屏障，外周血T淋巴細(xì)胞難以通過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮吞噬、清除異物的免疫作用。本

9、實(shí)驗(yàn)將HLA-G1+hES細(xì)胞誘導(dǎo)分化DA神經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HLA-G1不僅能夠抑制BV2細(xì)胞的增殖，還能顯著抑制BV2細(xì)胞分泌IL-1β、IFN-γ炎性因子。
　　 用人晶芯片高通量篩查HLA-G1+hES細(xì)胞基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示HLA-G1可差異性調(diào)節(jié)425個(gè)基因(比率>2.0或<0.5)，上調(diào)203個(gè)基因、降調(diào)222個(gè)基因。在所有差異性調(diào)節(jié)的基因中，參與分子粘附途徑、腫瘤生長(zhǎng)因子-β信號(hào)途徑及免

10、疫應(yīng)答的基因占主導(dǎo)。HLA-G1可差異性調(diào)節(jié)7種免疫相關(guān)基因，正是這種協(xié)同效應(yīng)能夠解釋HLA-G1+hES細(xì)胞具有免疫抑制效應(yīng)。
　　 本課題以慢病毒整合到宿主基因組的方法對(duì)hES細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，將外源基因HLA-G1表達(dá)在hES細(xì)胞中，得到一株穩(wěn)定表達(dá)HLA-G1的人胚胎干細(xì)胞。HLA-G1+hES細(xì)胞在形態(tài)上與正常hES細(xì)胞無(wú)明顯差別均呈克隆性生長(zhǎng)，HLA-G1能夠與正常hES細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2共同表達(dá)

11、于HLA-G1+hES細(xì)胞上，而且通過(guò)體內(nèi)SCID小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HLA-G1+hES能夠形成包含三胚層的畸胎瘤。實(shí)驗(yàn)初步表明HLA-G1不影響hES細(xì)胞的多能性，隨著hES細(xì)胞的分化，HLA-G1仍然能夠持續(xù)表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)HLA-G1的hES及由此來(lái)源的分化終末細(xì)胞均具有免疫抑制作用，HLA-G1以三種不同的表現(xiàn)形式，在體外均可抑制T細(xì)胞的增殖，減少小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子IL-1β、IFN-γ。無(wú)論是HLA-G1+hES還是由此分化